云南红豆杉中紫杉烷类二萜成分化合物的遗传毒性研究

王佳颖，花文婷，余　丹

(南京中医药大学 药物安全性评价研究中心，江苏 南京210023)



云南红豆杉中紫杉烷类二萜成分化合物的遗传毒性研究

王佳颖，花文婷，余丹

(南京中医药大学 药物安全性评价研究中心，江苏 南京210023)

摘要目的：研究云南红豆杉中四种紫杉烷类二萜成分化合物(2-去乙酰氧基紫杉宁E、7-去乙酰氧基紫杉宁J、2-去乙酰氧基去肉桂酰基紫杉宁、巴宁亭酸)的安全性。方法：采用Alarmblue检测采用四种紫杉烷类二萜成分化合物在CHL细胞上的细胞毒性，采用CHL细胞染色体畸变实验和Ames试验，观察云南红豆杉中四种紫杉烷类二萜成分化合物遗传毒性作用。结果：四种紫杉烷类二萜成分化合物在CHL细胞株上IC50>0.5 mg/mL；未对鼠伤寒沙门氏杆菌组氨酸缺陷型菌株回复突变数产生影响；未使得CHL染色体畸变率增加。结论：在本实验条件下，未观察到2-去乙酰氧基紫杉宁E、7-去乙酰氧基紫杉宁J、2-去乙酰氧基去肉桂酰基紫杉宁、巴宁亭酸对CHL细胞有明显的细胞毒性以及未观察到体外遗传毒性。

关键词遗传毒性；云南红豆杉；紫杉烷类二萜成分

紫杉醇是现有的抗癌天然药物中疗效最好、最具潜力的药物之一。由于其独特的化学结构和作用机制而倍受世人关注[1]，由此引发了人们对红豆杉属(Taxus)植物的研究热潮。到目前为止化学家们已从红豆杉属植物中分离出紫杉烷类二萜化合物300多个。云南红豆杉是我国特有树种，自1990年张宗平等[2]报道其化学成分以来，各国学者对其进行了广泛的研究，到目前为止已从云南红豆杉的各个部位分离得到紫杉烷类二萜100多个，由于云南红豆杉中紫杉醇含量较高，已成为提取紫杉醇的主要原料，同时也被加工成为中药饮片。然而对于云南红豆杉的研究现多集中于其化学成分的研究[3-4]，对于其中除紫杉醇外的其他紫杉烷类二萜化合物的药理毒理学研究相对较少，随着紫杉烷类抗肿瘤药物研究的深入，对于其他紫杉烷类二萜化合物的毒理学研究显得尤为迫切和必要。

遗传毒理学是研究化学物质和物理因子对机体遗传物质的作用，阐明遗传毒物对机体健康造成的后果以及作用机制，为保护人体健康安全提供科学依据的一门毒理学分支学科。

而目前，许多国家和国际机构都高度重视化学物(药物)的致突变性，并充分认识到其在遗传性疾病和癌症发生中的重要性。国家的有关政策法规也高度重视化学物(药物)致突变性，并且陆续颁布的有关食品、药物、农药以及医疗用品安全性药理学评价程序中都将致突变性研究作为一项重要的评价指标之一[5- 6]。因而研究与探讨云南红豆杉中紫杉烷类二萜成分的遗传毒性在紫杉烷类抗肿瘤药物研究开发、云南红豆杉饮片质量及安全性控制中具有极其重要的意义。

按照ICH指导原则的要求，并根据大量的文献调研[7-9]，本研究通过体外细菌突变实验、动物细胞染色体畸变实验试图在体外水平对已得到的云南红豆杉中紫杉烷类化合物2-去乙酰氧基紫杉宁E、7-去乙酰氧基紫杉宁J、2-去乙酰氧基去肉桂酰基紫杉宁、巴宁亭酸进行遗传毒性的研究和评价，为云南红豆杉饮片质量与安全性控制提供理论基础。

1实验材料

1.1受试药物

2-deacetoxytaxinineE(2-去乙酰氧基紫杉宁E); 7-deacetoxytaxinineJ( 7-去乙酰氧基紫杉宁J); 2-deacetoxydecinnamoyltaxinineJ(2-去乙酰氧基去肉桂酰基紫杉宁J);baccatin3 (巴宁亭酸)均由江苏省食品药品检验监督研究院制备提取。分别用DMSO溶解，制备成1mmol/L储存液，临用前用生理盐水稀释成所需浓度。

1.2试剂和药品

二甲基亚砜，DMSO，Amresco0231 - 100mL；叠氮钠，LotNo.404C057，CAS：26628-22-8，含量≥98%，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；敌克松，LotNo.4030165-A，CAS：140-56-7含量≥98%，AccuStandard；2-氨基芴，LotNo.10139040，CAS：153-78-6，含量≥98%，AlfaAesar；1,8-二羟基蒽醌，LotNo.LC60P31，CAS：117-10-2，含量≥98%，北京百灵威科技有限公司；丝链霉素，LotNo. 130438-200502，CAS：57-92-1，含量99.6%，中国药品生物制品检定所；环磷酰胺，LotNo. 100234-200502，CAS：50-18-0，含量99.6%，中国药品生物制品检定所；β-萘黄酮，LotNo.10159729，CAS：6051-87-2，含量≥98%，AlfaAesar；秋水仙碱，LotNo.C22H25NO6，CAS：64-86-8，含量≥98%，BioSharp；NADP，LotNo.B0014K061100，BioSharp；G6PC，LotNo.SLBL0293V,Sigma; 改良型1640培养基(RPMI-1640)，LotNo. 1590348，Gibco；0.25% 胰酶(Trypsin-EDTA)，LotNo. 25200056，Gibco；双抗(PenStrep)，LotNo. 1568586，Gibco；四季青胎牛血清，LotNo. 150211，浙江天杭生物科技有限公司。Alarmblue，Lot：156450SA，InvitrogenUSA；Hepes，LotNo. 513C0412，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；琼脂粉，LotNo.402H0324，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；L-组氨酸，LotNo.1018A0518，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；柠檬酸，LotNo. 225A046，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；牛肉膏，LotNo. 20150615，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；结晶紫，LotNo. 125C044，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；蛋白胨，LotNo. 603B054，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；NaNH4HPO4·4H2O，LotNo. 20150812，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；Na2HPO4·12H2O，LotNo. 20150721，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；K2HPO4·3H2O，LotNo. 20150721，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；C6H12O6，LotNo. 405A0920，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；氨苄青霉素，LotNo. 104D0319，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；D-生物素，LotNo. 911A0420，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；四环素，LotNo. 1104B0416，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；NaCl，LotNo. 10019318，国药集团化学试剂有限公司；冰醋酸，LotNo. 20150326，国药集团化学试剂有限公司；丙三醇，LotNo. 20130913，国药集团化学试剂有限公司；甲醇，LotNo. 14081911787，南京化学试剂有限公司。

1.3仪器

自动细胞计数仪，IC1000，上海睿钰生物科技有限公司；自动菌落分析仪，Protocol3，SYNBIOSIS；二氧化碳培养箱，HERAcell150i，德国Thermo；微生物培养箱，IMH180，德国Thermo；摇床，MaxQ4450，德国Thermo；高速冷冻离心机，ALLEGRAX-15R，美国BACDMAN；TS100倒置显微镜，ITS100，日本Nikon；酶标仪，瑞士帝肯，M1000PRO。

1.4细胞及培养

CHL细胞株，由江苏省食品药品检验监督研究院提供。培养基为含有10%的四季青胎牛血清的RPMI-1640，置于5%二氧化碳，37℃培养箱培养。

1.5菌株

实验选用TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535菌株进行试验，菌株由南京中医药大学药物安全性评价研究中心提供。正式实验之前，需对试验拟用的五种鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型菌株进行了组氨酸需求试验、抗氨苄青霉素试验、结晶紫敏感试验、紫外线敏感试验、抗四环素试验和自发回变试验。 结果显示: 各种菌株的特性正常，自发回复突变数均在正常范围内。因此，各菌株基因型均符合实验要求。

1.6动物

SPF级SD大鼠5只，雄性，体重200～220g，购自上海杰思捷实验动物有限公司。实验动物生产许可证号码：SCXK(沪)2013-0006。动物合格证编号：2010002604205。动物饲养于南京中医药大学药物安全性评价研究中心SPF级动物房。实验动物使用许可证：SYXK(苏)2014-0003。饲养温度：20～26 °C；湿度：40%～70%；换气次数8～10次/小时；工作照明：100～200lx，动物照明：15～20lx，明暗交替12小时；噪音：≤60dB；氨浓度<20mg/kg；落下菌数：≤3CFU/0.5h·90mm平皿。饲养条件符合饲养条件符合国标GBl4922. 2—2001。

2统计方法

各组计量数据均以平均值±标准差(M±SD)表示。采用GraphPadPrism5.0进行统计，两组间采用Student’sTest。多组间比较采用单因素方差分析法(One-wayANOVA)及Dunnett法。

3实验方法

3.1S9制备

采用苯巴比妥和β-萘黄酮作为诱导剂制备S9[10-12]，苯巴比妥和β-萘黄酮经灌胃给药，剂量均为80mg/kg，连续3天。处死前16小时停止饮食，自由饮水。动物断头处死后动物断头处死后，令血液流尽，剥去皮毛，在无菌及4℃条件下进行下列步骤操作：用冰冻的0.15mol/LKCl溶液从门静脉处注入肝脏，以冲洗肝脏。摘取肝脏，按每克肝重加3mL冰冷的0.15mol.L-1KCl液匀浆，0～4℃条件下，9 000×g，10min，过滤取上清液。分装并于-80℃保存备用，每批S9匀浆应在完全培养基上做无菌试验。

3.2IC50测定

CHL以1 000个细胞每孔种于386孔板黑色底透的细胞培养板，每孔接种1000个细胞，每孔45μL。孵育24h后，加入不同浓度2-去乙酰氧基紫杉宁E、7-去乙酰氧基紫杉宁J、2-去乙酰氧基去肉桂酰基紫杉宁、巴宁亭酸，再孵育24h后，每孔加入5μL的Alarmblue，6小时后测定荧光强度，采用酶标仪检测吸光度，激发波长为530nm，发射波长 590nm。

3.3染色体畸变实验

将指数生长的CHL细胞接种在75mL的培养瓶中, 细胞浓度为3×104/mL，每瓶接种5mL，共接种32瓶，培养24 小时后给药。试验组共分两部分，不给S9组和给予S9组，均包括2-去乙酰氧基紫杉宁E、7-去乙酰氧基紫杉宁J、2-去乙酰氧基去肉桂酰基紫杉宁、巴宁亭酸高中低三个剂量组，剂量分别为0.5mg/mL、0. 25mg/mL和0.125mg/mL，阴性对照组(生理盐水)和阳性对照组。其中不给予S9组阳性药为丝裂霉素，药物剂量为0.4μg/mL；给予S9组阳性药为环磷酰胺，药物浓度为20μg/mL。不给予S组加入药物后培养24小时。给予S9组，给药后培养4小时后用PBS洗涤细胞3次，重新加入培养基继续培养至24小时。终止培养前4小时，于5mL全培养液中加0.1mL秋水仙碱稀释液，秋水仙碱终浓度为0.2μg/mL。随后终止培养，每瓶分别取细胞培养液制作染色体玻片标本，各组观察100个中期分裂相细胞，计数其染色体畸变率。试验重复1次。

3.4Ames实验

采用平板掺入法进行试验，2-去乙酰氧基紫杉宁E、7-去乙酰氧基紫杉宁J、2-去乙酰氧基去肉桂酰基紫杉宁、巴宁亭酸分别设5个剂量组，剂量分别为0.05、0.015 8、0.005、0.001 58、0.000 5mg/皿，同时设定阴性对照组和阳性对照组，平行做加S9和不加S9试验。37 ℃培养72小时，计数各平扳菌落数并算出均值，试验重复1次。阳性对照组药物及给药剂量见表1。

表1　Ames试验阳性药物及给药剂量

4实验结果

4.1IC50结果

经过试验，发现2-去乙酰氧基紫杉宁E、7-去乙酰氧基紫杉宁J、2-去乙酰氧基去肉桂酰基紫杉宁、巴宁亭酸在药物可溶解的最高剂量0.5mg/mL均未对CHL细胞产生毒性作用。因此，我们认为此四种物质均无细胞毒性。因此，后续染色体畸变试验以及Ames试验均已药物可溶解的最高浓度作为给药的高浓度剂量。

4.2染色体畸变实验结果

染色体畸变试验结果如经检测，未给予S9组，溶剂对照组染色体畸变率为1%，丝裂霉素组(0.4μg/mL)染色体畸变率为39%；而给予S9组，溶剂对照组染色体畸变率为1%，环磷酰胺组(20μg/mL)染色体畸变率为32%；结果表明试验系统可靠。而各试验组染色体畸变率均小于5%，呈阴性结果。表明，在该试验条件下，2-去乙酰氧基紫杉宁E、7-去乙酰氧基紫杉宁J、2-去乙酰氧基去肉桂酰基紫杉宁、巴宁亭酸对CHL细胞染色体无致畸作用。

表2　染色体畸变试验结果

注：P(Polyflod)多倍体、G(Gap)裂隙、B(BREAK)断裂、R(环)RING、E(EXCHANGE)交换、O(Otheraberrations)；畸变率<5，阴性(-)；畸变率>5，阳性(+)；畸变率>20，阳性(++)。

4.3Ames实验结果

Ames实验结果如表3～6所示。阳性药的菌落数均高于阴性对照组自发回复突变数2倍以上，表明实验系统可靠。2-去乙酰氧基紫杉宁E、7-去乙酰氧基紫杉宁J、2-去乙酰氧基去肉桂酰基紫杉宁、巴宁亭酸给药组的菌落数与阴性对照组相比，无显著性差异。表明在试验条件下，2-去乙酰氧基紫杉宁E、7-去乙酰氧基紫杉宁J、2-去乙酰氧基去肉桂酰基紫杉宁、巴宁亭酸均未对鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型菌株的回复突变数产生影响。

5结论和讨论

紫杉醇抗肿瘤作用靶点为微管蛋白，帮助微管蛋白二聚体装配成微管，并阻止其解聚而稳定微管，从而抑制细胞有丝分裂[13-14]。微管是细胞骨架重要的组成部分，起到维持细胞形态，固定和支持细胞器位置的重要作用。同时它参与构成纤毛、鞭毛、中心粒以及基体，因而参与细胞收缩、伪足运动及细胞内物质运输。在有丝分裂期间，微管参与构成纺锤体，在分裂细胞中牵引染色体到达分裂极过程中发挥着重要作用。本研究采用的四个化合物均为云南红豆杉中紫杉烷类结构，推测可能与紫杉醇作用靶点相似。同时程东等[15]研究发现，紫杉醇可诱导CHL细胞染色体畸变率增加。因而，本研究采用Ames实验和CHL细胞染色体畸变实验评价2-去乙酰氧基紫杉宁E、7-去乙酰氧基紫杉宁J、2-去乙酰氧基去肉桂酰基紫杉宁、巴宁亭酸的体外遗传毒性。

Ames实验结果显示，在加S9和未加S9实验系统下2-去乙酰氧基紫杉宁E、7-去乙酰氧基紫杉宁J、2-去乙酰氧基去肉桂酰基紫杉宁、巴宁亭酸并未增加鼠伤寒沙门氏杆菌组氨酸缺陷型的回复突变数，表明该四种化合物既没有间接诱变活性，也没有直接诱变活性。主要可能由于该类物质主要作用于微管，对DNA无直接损伤作用，因为未对鼠伤寒沙门氏杆菌组氨酸缺陷型菌株产生致突变作用，回变菌落数没有增加。

本研究检测了2-去乙酰氧基紫杉宁E、7-去乙酰氧基紫杉宁J、2-去乙酰氧基去肉桂酰基紫杉宁、巴宁亭酸在CHL细胞上的细胞毒性，发现在可溶解的最高浓度下，四种化合物均未对细胞产生明显的细胞毒性，因此我们初步认为四种化合物在CHL细胞上均为无细胞毒性物质。染色体畸变实验可以反映受试物对哺乳动物骨髓细胞染色体的作用能力，以检测致突变物对遗传物质的损伤情况[16-17]。结果显示，该四种化合物未导致CHL细胞的染色体畸变率增加，因此该四种物质对哺乳动物体细胞没有致突变型。

综上所述，本研究表明在现有实验条件下，2-去乙酰氧基紫杉宁E、7-去乙酰氧基紫杉宁J、2-去乙酰氧基去肉桂酰基紫杉宁、巴宁亭酸未发现有体外遗传毒性。

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收稿日期：2015-08-15

基金项目：南京中医药大学青年自然科学基金资助。

作者简介：王佳颖，女，助理研究员。研究方向：药物毒理学。E-mail：lisa850913@hotmail.com

doi：10.3969/j.issn.1006-9690.2016.02.009

中图分类号：R285

文献标识码：A

文章编号：1006-9690(2016)-02-0027-07

GeneticToxicityofTaxaneDiterpenoidsofTaxus yunnanensis

WangJiaying,HuaWenting,YuDan

(CenterforDrugSafetyEvaluationandResearch,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023，China)

AbstractObjective：To evaluate the safety of 2-deacetoxytaxinine E, 7-deacetoxytaxinine J, 2-deacetoxydecinnamoyl taxinine J and baccatin 3. Methods: Alarmblue Assay was performed to research the IC50of these four compounds in CHL cell. Then, chromosome aberration test in CHL cell and Ames test were conducted to investigated the genetic toxicity of four compounds in vitro.Results: In CHL cell, the IC50was>0.5 mg/mL. No genetic toxicity was observed. Conclusion: Under the conditions of this experiment, four compounds have neither cell toxicity nor genetic toxicity.

Key wordsgenetic toxicity; Taxus yunnanensis; taxane diterpenoids