超声波转化方法将外源性质粒导入甾短杆菌的研究

张慧，杨胜利

（1浙江省质量检测科学研究院，浙江杭州 310018；2浙江工业大学药学院，浙江杭州 310014）



·科技论文·

超声波转化方法将外源性质粒导入甾短杆菌的研究

张慧1，杨胜利2

（1浙江省质量检测科学研究院，浙江杭州 310018；2浙江工业大学药学院，浙江杭州 310014）

摘要:目的:建立甾短杆菌的高效超声波转化方法，为利用甾短杆菌重组表达功能基因提供方法基础。方法∶采用超声波诱导的方法把外源DNA转化进甾短杆菌基因组中。通过对甾短杆菌生长状态，超声波作用条件等影响因素进行探索。结果∶当采用OD600为0.7的菌体制备感受态细胞、超声波强度为400W、作用时间为40min和质粒浓度为0.2 g/L时，转化效率达到最大值，为384个转化子/ μg DNA。经抽样PCR鉴定所得到的转化子均为阳性克隆。结论通过优化超声波转化条件，从而获得了高效电转化技术方法。

关键词：甾短杆菌；超声波；转化率

近年来由于功率超声设备的普及和发展，超声波对生物反应过程的影响正引起人们强烈的兴趣和高度重视。研究表明：合适强度的超声波作用于生物反应培养液，可增强基因转移效率，增加细胞膜的通透性和选择性，促进酶的分泌，增强细胞的代谢作用，从而，能缩短反应时间，提高产品质量和产量。如在乳酸发酵过程中，采用超声波处理可以提高发酵效率［1，2］。在酵母产酒精的研究中也取得了相类似的效果［3，4］，并且在提高乙醇产量的同时，对酵母生长也起到促进作用［5］。尽管利用超声波作用生物反应过程的研究有所报道，但是多集中在乳酸发酵和乙醇发酵，超声促进微生物转化技术研究国内外未见文献报道。本项目拟利用超声波诱导携带胆固醇氧化酶基因的质粒分别插入甾短杆菌细胞，以期获得高产胆固醇氧化酶的菌株，并建立超声波诱导基因转化的新方法。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株和质粒

胆固醇氧化酶生产菌（Brevibacterium sp.），由本实验室筛选并保存；质粒pET28a-choB，由本实验室自行构建。

1.1.2培养基

LB培养基（蛋白胨∶10g，酵母提取物∶5g，氯化钠∶10g，水：1L）。

1.1.3主要试剂和仪器

超声波（定制）无锡雷士超声波设备有限公司；ABI公司2720型PCR仪；ALPHA2200 Imager凝胶成像系统等。

1.2感受态细胞的制备

菌种于LB培养基中，200r/min，30℃振荡培养一定时间，12000r/min，10min，4℃离心收集细胞，制备超声波转化感受态细胞。

1.3大肠杆菌超声波转化方案

超声波转化中，取40μL的甾短杆菌感受态细胞，加入适量质粒（质粒浓度100ng/μL）；二甲基亚砜作为缓冲液，调至质量分数1%；温度调至30℃；pH调至7.0；超声波场强为200～500W，处理时间为20～50min。

1.4阳性转化子的筛选和鉴定

当转化结束后，将转化后的菌液涂布到含Kan和Cam的LB平板上进行筛选，随机选取转化平板上的转化子提取基因组DNA，以其为模板，采用特异性引物进行PCR验证。所用引物：5'-TTCCATGGCC⁃GATAGCCGGGCGAACAG-3'和 5'-GCGAATTCT⁃CACTGGATGTCGGACGAGATGA-3'。PCR反应条件为∶94℃5 min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃5min。凝胶电泳检测重组载体是否插入甾短杆菌基因组。

1.5诱导表达

挑取阳性克隆单菌落并接种于4mL含有浓度为50μg／mL Cam和50μg／mL Kan的LB液体培养基中，于30℃，200r／min震荡过夜。取1mL培养物，将其转接于50mL含有浓度为50μg／mLCam和50μg／mL Kan的LB液体培养基中30℃、200 r／min震荡培养至菌体浓度OD600约为0.7。向培养物中加入1mmoL／L的IPTG诱导培养。收集菌体供电泳分析及酶活力测定。

1.6菌体破碎

12，000r／min，4℃离心5 min收集菌体后，用50mmol/L的pH7.5的磷酸洗涤悬浮菌体，超声波破碎仪500w，工作10s，间歇5s，99个循环，破碎菌体。4℃12，000r／min离心15 min去除细胞碎片沉淀，取上清酶活分析。

1.7酶活力测定

3mL溶液A（叠氮钠，0.2g/L；4-氨基-安替比林，1mmoL／L；苯酚，6mmoL／L；过氧化物酶，5，000U／L；磷酸钾缓冲液，25mmoL／L，pH7.5），150μL溶液 B（胆固醇，8.26g/L；Triton X-100，4.26%；异丙醇为溶剂），50μL酶液，37℃，反应5min，沸水浴3min，于500nm测吸光值。酶活（U／mL）= 1.6832×A500。

酶活力单位定义：37℃，1min转化1μmol胆固醇生成胆甾-4-烯-3-酮的酶量定义为1个酶活单位（U）。

2　结果

2.1甾短杆菌不同生长时期对转化效率的影响

细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称称为感受态。为确定甾短杆菌制备感受态细胞的最佳生长时期，分别在甾短杆菌培养OD600值为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7和0.8后，制备感受态细胞，将不同生长时期制备的感受态细胞与100ng的质粒DNA在300W的超声场强度下进行超声波转化。实验结果表明：OD600值为0.7培养物制备的感受态细胞超声波转化效率最高，能达到241个转化子/μgDNA（图1）。

图1　不同生长时期甾短杆菌的超声波转化效率

2.2超声波强度对转化效率的影响

图2　超声波强度对转化效率的影响

100ng质粒DNA加入OD600值为0.7的甾短杆菌感受态细胞，分别在200W、250W、300W、350W、400W、450W和500W的7种不同超声场强度下进行转化。结果见图2，在400W的电场强度下的电转化效率最高可达289个转化子/μg DNA。当超声场强度超过400W时超声转化效率随着超声场强度增大而逐渐降低。

2.3超声波作用时间对转化效率的影响

固定甾短杆菌培养OD600值为0.7，超声场强度为400W，细胞分装体积为40μL，预转化的质粒为0.1μg，分别选取超声波时间，设置不同水平进行超声波转化试验，结果见图3。超声波处理时间为40min时转化效率最高为356个转化子/μgDNA），随着超声波处理时间的延长，转化效率增加，当超声波处理时间超过40min时，转化效率开始下降。

图3　超声波处理时间对转化效率的影响

2.4DNA浓度对转化效率的影响

采用上述优化的实验条件，大肠杆菌经培养OD600值为0.7后制备感受态细胞，分别加入不同量的质粒DNA，在400W的超声场强度下进行超声转化。结果见图4，DNA量在0.01～1μg，转化效率随DNA量的增加而迅速增加，当DNA量达到0.2g/L时，转化效率增加趋势趋于平缓，达到384个转化子/μgDNA。

图4　质粒浓度对转化效率的影响

2.5大肠杆菌超声波转化子的检测和分析

由于质粒pET28a-choB携带胆固醇氧化酶基因，故转化成功的阳性克隆可以将其周围培养基中的胆固醇转化成胆甾-4-烯-3-酮，从而使菌落周围出现透明圈。随机挑取具有透明圈的菌落，扩大培养，提取质粒后用酶切质粒，进行核酸凝胶电泳，结果见图5。由图5可知，转化质粒大小接近于1700 bp，与胆固醇氧化酶基因大小一致，说明转化成功。

图5　转化子的PCR验证

2.6酶活鉴定及稳定性研究

按照“材料与方法”所述，在添加了适当浓度抗生素的LB培养基中培养阳性转化子至菌体浓度OD600为0.7左右时，向培养基中加入IPTG至终浓度为1mmol／L，诱导培养4h。收集菌体，破碎细胞后，测定酶活力。同时以Brevibacterium sp.，未经IPTG诱导的阳性转化子为对照分别测定酶活力，酶活测定结果见表1。

表1　胆固醇氧化酶活力测定结果

为检测质粒pET28a-choB在超声波转化甾短杆菌转化子中的遗传稳定性，将转化子在不含Kan和Cam的LB平板上连续转接3次，随机挑取100个单菌落转接到Kan和Cam的LB平板上，未发现抗性消失的菌落。随机选取5个菌落，经PCR扩增和测序验证，结果与超声波转化子验证一致。表明pET28a-choB质粒能在甾短杆菌中稳定遗传。

参考文献：

［1］Thi M.P.N.，Yuan K.L.Stimulating fermentative activities of bifi⁃dobacteria in milk by high intensity ultrasound［J］.International Dairy Journal.2009，Vol∶19，410-416.

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［3］Saoharit N.，Prachand S.，Mary L.R.et al.Ultrasound improved ethanol fermentation from cassava chips in cassava-based ethanol plants［J］.Bioresource Technology.2010，Vol∶101，2741-2747.

［4］Svetlana N.，Ljiljana M.，Marica R.，et al.Ultrasound-assisted pro⁃duction of bioethanol by simultaneous saccharification and fermen⁃tation of corn meal［J］.Food Chemistry.2010，Vol∶122，216-222.

［5］Ahmad Z.S.，Azilah A.，Rosli M.Y.et al.Ultrasound-assisted fer⁃mentation enhances bioethanol productivity［J］.Biochemical Engi⁃neeringJournal.2011，Vol∶54，141-150.

Study on exogenous plasmids transformed into Brevibacterium sp. by ultrasonic

ZHANG Hui1，YANG Sheng-li2
（1Zhejiang Institute of Quality Inspection Science，Hangzhou Zhejiang 310018；
2The College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou Zhejiang 310014）

Abstract:Objective∶A high efficient method of ultrasonic transformation was established to provide the basis for expressing the functional genes in Brevibacterium sp.Methods∶The method used to extraneous DNA was transformed into Brevibacterium sp.genome by ultrasonic transformation.The main factors that affect the transformation efficiency were explored and optimized.Results∶The optimal conditions for ultrasonic transformation of Brevibacterium sp.were obtained with the maximum transformation efficiency of 384 transformants/μg plasmid DNA when the Brevibacterium sp.cells of OD600 to 0.7 were used for competent cells，and the ultrasonic treatment were under the conditions of field intensity of 400W，40min and 0.2 g/L plasmid DNA.All the transformants were confirmed to be positive clones.Conclusion The highly effective transformation technique was obtained through optimizingthe ultrasonic transformation conditions.

Keywords:brevibacterium sp.；ultasonic；transformation efficiency

doi：10.3969/j.issn.1008-1267.2016.01.007

中图分类号：R965.2

文献标志码：A

文章编号：1008-1267（2016）01-0019-04

收稿日期：2015-09-06

基金项目：浙江省科技厅公益项目（2014C32034）

通信作者：杨胜利（1972-），男，副教授，博士，研究方向为发酵工程。