小儿消化性溃疡患者外周血单个核细胞中转录因子RORγt mRNA的表达

张伦敏 张伦友 刘静

小儿消化性溃疡患者外周血单个核细胞中转录因子RORγt mRNA的表达

张伦敏 张伦友 刘静

目的 探讨Th17细胞及其转录因子RORγt mRNA在小儿消化性溃疡致病机制中的作用。方法 采用实时荧光定量PCR法检测28例小儿消化性溃疡患者和28例正常人对照组外周血单个核细胞中RORγt mRNA的表达水平。结果 小儿消化性溃疡患者和正常人对照RORγt mRNA两组比较差异有高度统计学意义(t＝－5.772，t＝－6.105，P＜0.001)。结论 转录因子RORγt高表达可能在小儿消化性溃疡致病机制中具有重要作用。

消化性溃疡；RORγt；外周血单个核细胞

小儿消化性溃疡 (peptic ulcer)是指胃和十二指肠的慢性溃疡，各年龄均可发病，病因与诸多因素有关，确切发病机制至今尚未完全阐明，目前大多数研究者认为溃疡的形成是由于对胃和十二指肠黏膜有损害作用的侵袭因子与黏膜因素之间失去平衡的结果[1]。Th17细胞是一类新近发现的CD4+T细胞亚群，主要分泌IL-17、IL-22等细胞因子，并通过这些细胞因子发挥生物学功能，在感染性疾病、自身免疫性疾病及移植排斥等疾病的发生、发展中起重要作用。维甲酸相关孤核受体γt(retinoid-related orphan nuclear receptor γt，RORγt)是Th17细胞特异性转录因子，其水平高低可以反映Th17细胞功能状态。本研究通过检测小儿消化性溃疡患者结肠组织和外周血单核细胞中Th17细胞特异性转录因子RORγt mRNA的表达水平，进一步探讨小儿消化性溃疡发病机制。

1 对象与方法

1.1 对象 小儿消化性溃疡组选择2014-01—2015-03遵义市第一医院门诊及住院确诊为小儿消化性溃疡患者28例，诊断均符合第八版人民卫生出版社儿科学诊断标准。其中，男患15例，女患13例，年龄0～6岁。对照组28例健康者，对照组与小儿消化性溃疡组相比年龄、性别构成差异无统计学意义(P＞0.05)。

1.2 主要试剂和仪器 淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品有限公司，RPMI-1640购自美国Sigma公司，逆转录试剂盒购自宝生物(大连)有限公司，实时荧光定量PCR仪购自Bioer公司。

1.3 方法 抽取小儿外周静脉血3 mL，淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，Trizol一步法提取总mRNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，核酸微量分析仪测其RNA的浓度及其OD值(以DEPC水调零)。反转录条件为：37℃ 15 min；85℃ 5 sec。RT-PCR反应条件：94℃预变性3 s，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环。循环结束后应用系统软件绘制扩增曲线、熔解曲线。用2－△△CT法计算相对表达量，△Ct＝Ct(目的)－Ct(内参)。

1.4 PCR特异性引物 内参基因β-actin上游 ：5'-ACAGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3'；下 游 ：5'-CATGCCGGAGCCGTTGTCGAC-3'，扩增产物片段长度101 bp。目的基因RORγt上游：5'-CTGCTGAGAAGGACAGGGAGCCAA-3'；下游：5'-AGGAGTAGGCCGCGTTACAGC-3'，扩增产物片段长度184 bp。所有引物均由大连宝生物有限公司合成。

1.5 统计学处理 用统计软件SPSS 13.0统计，统计结果用(±s)表示，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

部分标本的PCR扩增产物(图1)。β-actin、RORγt基因的PCR扩增产物的熔解曲线均为单峰，表明扩增产物单一，扩增曲线拐点清楚，指数期明显，基线平，无上扬现象，说明扩增产物良好(图2～5)。

图1 小儿消化性溃疡患者外周血RORγt扩增产物鉴定

图2 β-actin扩增曲线

图3 β-actin熔解曲线

图4 RORγt扩增曲线

图5 RORγt熔解曲线

小儿消化性溃疡患者外周血PBMCs中RORγt mRNA表达水平为(5.51±4.00)，对照组为(1.11±0.51)，小儿消化性溃疡患者外周血PBMCs中RORγt mRNA表达水平明显高于对照组，两者比较差异有高度统计学意义(t值=－5.763，P值＜0.001)。

3 讨论

小儿消化性溃疡是儿科消化系统的主要疾病之一，其发病率有逐年增高的趋势，近年来小儿消化性溃疡的临床表现不像成人那样典型，各种症状体征的发生与成人有明显差异，溃疡导致出血引起的症状也比较突出，不少患儿以贫血、面色苍白为首发症状，随着现代医学的进步，消化性溃疡的研究有所突破，已从传统的实验室检查向分子生物学检查迈进。

Th17细胞是近年来发现的一种CD4+T细胞亚群，是最早参与抗感染免疫的效应性T细胞，其主要分泌IL-17和IL-17F细胞因子，已有研究表明IL-17与HP感染有关，IL-17表达水平显著高于正常对照组[2]，血清IL-17具有极强的促炎性，刺激趋化因子、炎性因子的产生，同时通过趋化因子与中性粒细胞而推动白细胞的募集，进而充分发挥炎性反应作用[3]，另外血清IL-17可以促进人体局部出现趋化因子，强化胃肠道局部炎症的扩展[4]。RORγt是控制Thl7细胞分化的特异性转录因子，一方面RORγt直接诱导，促进IL-17A表达，另外一方面RORγt与活化的T细胞核因子相互作用抑制IL-2的产生，间接促进Thl7细胞的表达[5]。

目前少有转录调节因子RORγt与小儿消化性溃疡发病关系的报道，本研究通过检查小儿消化性溃疡患者外周血中Th17细胞中RORγt mRNA表达水平，探讨RORγt mRNA在小儿消化性溃疡发病机制中的作用，实验结果显示小儿消化性溃疡患者外周血中转录因子RORγt表达水平显著高于正常人对照组，两组比较差异有高度统计学意义(P＜0.001)，RORγt表达水平升高，提示Th17细胞水平增加和活性增强。RORγt的高表达可能促进了Th17细胞分化，通过调节IL-17等致炎因子的分泌参与了小儿消化性溃疡的发生，转录因子RORγt可能在小儿消化性溃疡致病机制中发挥重要作用。但是RORγt在小儿消化性溃疡发病过程中更深层的作用及影响其转录因子表达因素还有待进一步研究。

[1]王卫平.儿科学[M].北京：人民卫生出版社，2015：8.

[2]陈曦.血清IL-17在消化性溃疡的水平变化及意义[J].现代预防医学，2012，39(7)：1756-1760.

[3]单君康.中西医结合治疗对消化性溃疡患者血清NO、IL-17表达的影响[J].中国中医急症，2011，20(12)：1920-1921.

[4]李金文，刘毅，赵莉.血清IL-17在消化性溃疡患者体内水平变化的意义[J].中国医药指南，2013.11(24)：130-131.

[5]王强，史洋溢，曹玫，等.Th17细胞及其特异性转录因子RORγt在儿童过敏性紫癜发病机制中的作用[J].中国小儿血液与肿瘤杂志，2015，4(2)：86-90.

Objective To explore the role of Th17 cell and its transcription factor of RORγt mRNA in the pathogenic mechanism of peptic ulcer in children.Methods Real-time fluorescence quantification PCR was adopted to detect the expression levels of RORγt mRNA in peripheral blood mononuclear cells among 28 children with peptic ulcer and 28 healthy controls.Results The expression level differences of RORγt mRNA in sufferers with peptic ulcer and the healthy controls were of high statistical significance(t＝－5.772，t＝－6.105，P＜0.001).Conclusion The high expression on transcription factor of RORγt mRNA may play an important role in pathogenic mechanism of peptic ulcer in children.

Peptic ulcer；RORγt；Peripheral blood mononuclear cell

2016-02-20)

1005-619X(2016)07-0734-02

10.13517/j.cnki.ccm.2016.07.028

563003 贵州省遵义市第一人民医院