微生物菌剂对牛粪堆肥中酶活性的影响

张祥永,任静,马彦霞,郁继华

(1.甘肃农业大学园艺学院，甘肃 兰州　730070；2.海口经济学院，海南 海口　571127)



微生物菌剂对牛粪堆肥中酶活性的影响

张祥永1，2,任静1,马彦霞1,郁继华1

(1.甘肃农业大学园艺学院，甘肃 兰州730070；2.海口经济学院，海南 海口571127)

摘要：【目的】 明确牛粪堆肥接种菌剂后在高温好氧堆肥过程中几种酶活性的动态变化，通过酶学角度揭示高温好氧堆肥的生物化学机理，为堆肥腐熟综合评价指标体系及腐熟阈值的制定提供科学依据.【方法】 以牛粪为堆肥原料，通过接种两种微生物菌剂处理，分析高温堆肥堆体温度与酶活性的变化特征.【结果】 接种菌剂有效地增加了堆肥温度，延长了高温期，且使脲酶、纤维素酶、蛋白酶活性水平与峰值得到明显提高.堆肥过程中过氧化氢酶与脲酶活性变化基本一致，后期高于前中期.多酚氧化酶活性呈不断下降并逐步稳定的趋势.堆肥前期纤维素酶出现峰值，不接种菌剂的处理(CK)蛋白酶活性中后期稳定升高.【结论】 接种菌剂纤维素酶活性与堆肥温度呈极显著负相关性(P<0.01)；多酚氧化酶两者则呈显著正相关性(P<0.05).接种菌剂2对过氧化氢酶、脲酶活性与堆体温度于不同阶段表现出显著(或极显著)相关性.CK的蛋白酶活性与堆体温度有极显著负相关性(P<0.01)，表明酶活性大小可作为牛粪堆肥过程中腐熟程度的生化评定指标.

关键词：酶活性；接种菌剂；温度；牛粪堆肥

随着畜禽业规模化养殖的不断扩大，畜禽粪便对自然环境造成的严重污染已不容忽视，成为阻碍养殖业集约化发展的新问题[1].堆肥法是解决这一问题既经济又有效的途径之一[2-4].高温好氧堆肥技术是一种集粪便处理和资源再生利用于一体的生物处理方法，在国内外倍受关注，腐熟过程不对环境造成二次污染、产品肥效长，并使土壤结构得到改善[5].

堆肥过程的实质是在微生物及其分泌的酶参与下进行的物质转化，包括原始有机物质降解为简单物质，再合成腐殖化物质的生物化学过程[6-9]，因此，对堆肥进程中酶活性变化的研究，有利于从生物化学方面了解堆肥的进程，进而推断腐解进程和机理.堆肥前期主要以矿质化作用占优势，而后期则以腐殖质化作用为主；水解酶使有机物得到分解，其活性的变化可以推断矿质化进程[9]；而氧化还原酶对合成新的稳定的有机化合物起到催化作用，且活性的变化可以推断堆肥过程腐殖化进程和强度[10].至今人们对畜禽粪便堆肥的研究多限于条件的控制(温度、氧气、C/N、PH等)[12-14]、微生物接种[15-16]和工艺参数的选择方面[17-18]，而在堆肥过程中依据酶活性变化规律判断堆肥进程以及外源菌剂对酶的作用的研究较少[19-21].鉴于此，本试验系统研究了牛粪堆肥接种菌剂后在高温好氧堆肥过程中几种酶活性的动态变化，通过酶学角度揭示高温好氧堆肥的生物化学机理，以期为今后农业废弃物的堆肥化过程监控提供理论参考依据.

1材料与方法

1.1试验材料

牛粪：试验用新鲜牛粪作为堆肥原料，取自甘肃农业大学动物与科学技术学院奶牛养殖场，原料基本理化性状如表1.

表1　堆肥原料的基本理化性状(烘干样)

菌剂：试验接种菌剂来源分别为南京农业大学提供的菌剂1(含8种纤维素分解细菌、真菌、放线菌)；甘肃科学院生物所提供的菌剂2，有效活菌数>80亿cuf/g.菌剂1为固体状，菌剂2为液态状.

1.2试验方法

堆肥试验于室外自然条件下进行，人工翻堆每3天1次.试验设3个处理，不接种菌剂的对照、接种菌剂1和菌剂2的处理，接种菌剂的量按各菌剂的使用方法进行.每个处理堆体体积约1.5 m3,呈高为1 m的锥体，设3次重复.分别于第0、1、3、7、14、21、28、35、42、49 天，采用五点法原则，在堆体表层10 cm深处取样.将5点样品充分混匀，风干粉碎后过筛待用.

1.3测定指标与方法

堆制开始后，每天下午17∶00～18∶00时，测量各堆体的温度.酶活性测定参照关松荫[22]的方法.过氧化氢酶活性测定采用高锰酸钾滴定法，脲酶活性测定采用苯酚钠比色法，蛋白酶活性测定采用茚三酮比色法，纤维素酶活性测定采用硝基水杨酸比色法，多酚氧化酶活性测定采用紫色没食子素比色法.

2结果与分析

2.1过氧化氢酶活性的变化

过氧化氢酶是一种保护酶，其活性变化与堆肥过程中微生物数量及有机质的转化速率密切相关[22].由图1可知，接种菌剂1的处理在21 d前过氧化氢酶活性逐渐升高，于第21天时活性达到最高值42.78 (0.002 mol/(L·g·20 min))；随后随着堆体温度的持续降低，其活性呈缓慢下降趋势，直至堆肥结束时略有上升.接种菌剂2处理的过氧化氢酶活性于前中期逐步提高，第35天时达到最大值39.45(0.002 mol/(L·g·20 min))低于菌剂1处理的最大值；但此时期过氧化氢酶活性与堆体温度成显著负相关(r=-0.904，n=6，P<0.05)，即过氧化氢酶活性随着堆肥高温期的结束而呈增加趋势.CK处理与接种菌剂处理的过氧化氢酶活性变化略有不同，在整个堆肥过程中，其最大值39.86(0.002 mol/(L·g·20 min))出现在堆肥结束.综合3个处理堆肥前后过氧化氢酶活性来看，各处理间差值变化较小，分别为菌剂1处理3.4(0.002 mol/(L·g·20 min))、菌剂2处理1.3(0.002 mol/(L·g·20 min))与CK处理4.7(0.002 mol/(L·g·20 min))，说明接种菌剂并未能提高堆肥过程中的过氧化氢酶活性.

图1　堆肥过程中过氧化氢酶活性变化Fig.1　Dynamic of catalase activity during composting

2.2脲酶活性的变化

脲酶的作用是将堆肥物料中的尿素水解成二氧化碳与氨，其与氮代谢密切相关[23]，而氮素形态的变化对物料氮素有效性有直接影响.本试验研究结果表明(图2)，堆肥初期，3个处理的脲酶活性均随着温度的升高而升高.于第28天，CK处理的脲酶活性达到最高值175.25 mg/(g·d)，此后逐渐降低.接种菌剂1处理堆肥第7天时脲酶活性升到峰值161.76 mg/(g·d)；堆肥中后期，脲酶活性不断上升，至堆肥结束，其活性值达到最大值308.66 mg/(g·d)；整个堆肥过程中，接种菌剂2处理的脲酶活性变化与接种菌剂1基本相同，但其值均高于接种菌剂1处理，第49天时活性最大值为385.39 mg/(g·d).在中后期内，菌剂2处理脲酶活性与温度的相关系数r=-0.969(n=5，P<0.01)，表明堆肥温度的持续降低对脲酶活性的稳定

图2　堆肥过程中脲酶活性变化Fig.2　Dynamic of urease activity during composting

升高影响较大.从整体分析，接种菌剂处理的脲酶活性明显高于CK处理，说明菌剂的添加可在很大程度上提高堆肥中的脲酶活性，进而使含氮物质得到加速矿化.堆肥结束后，接种菌剂的处理脲酶活性达到原始值的两倍以上，而在堆肥前期脲酶活性均较低，这是由堆肥进行时有机物碳化分解在前，氮素硝化作用在后决定的.

2.3多酚氧化酶活性的变化

多酚氧化酶是一种复合性酶，它可将环境中的酚类物质氧化成醌类，随后醌类又会与堆肥中的氨基酸、蛋白质、矿物及糖类等化合形成分子量不同的色素与有机质，完成堆肥中芳香族化合物的循环[24-26].因此，多酚氧化酶与酚类物质转化形成最初腐殖酸分子密切相关.由图3可以看出，堆肥前3 d堆体温度升高，多酚氧化酶活性反而下降.第3天接种菌剂1处理达到谷值0.073 mg/(g·2h)，第7天又出现峰值0.117 mg/(g·2h)，随后至堆肥结束多酚氧化酶活性不断下降.接种菌剂2处理的多酚氧化酶活性于整个堆肥过程中，基本呈下降趋势.接种菌剂处理的多酚氧化酶活性与堆肥温度密切相关，菌剂1处理在堆肥第0～7天二者的变化趋势相反，第7～49天酶活与温度呈显著正相关(r=0.776，n=7，P<0.05)，菌剂2处理于第14～49天时，酶活与温度也呈显著正相关(r=0.902，n=6，P<0.05)，即接种菌剂的处理降温期多酚氧化酶活性随着堆体温度的降低而下降.表明堆肥中后期菌剂会影响物料的腐殖化进程强度，但同时也促进了堆肥腐殖化的稳定进行.

图3　堆肥过程中多酚氧化酶活性变化Fig.3　Dynamic of polyphenoloxidase activity during composting

2.4纤维素酶活性的变化

在堆肥碳循环中纤维素酶起着极重要的作用，牛粪中含有大量较难分解的木质纤维素，而纤维素酶则通过参与纤维素内水解作用，最终将木质素、纤维素及半纤维素等分解为小分子的葡萄糖.因此，堆肥过程中纤维素含量的变化严重影响着堆肥腐殖化进程.本试验堆肥前期(0～3 d)，接种菌剂处理的堆体温度上升时，纤维素酶活性也随着升高；菌剂1处理酶活最大值达到39.26 mg/(g·d)，菌剂2处理酶活最大值为49.74 mg/(g·d)，这一时期纤维素大量分解；此后进入降温期，于第21天接种菌剂处理纤维素酶活性均出现谷值14.83 mg/(g·d)(菌剂1处理)、21.79 mg/(g·d)(菌剂2处理)；至堆肥结束纤维素酶活性缓慢升高.从整个堆肥过程来看，第21～49天时，接种菌剂1处理纤维素酶活性与温度呈极显著负相关(r=-0.998，n=5，P<0.01)，菌剂2处理两者的变化表现出极显著负相关(r=-0.970，n=5，P<0.01)，表明堆体温度的下降极有利于物料中木质素的分解.相对于接种菌剂的处理，CK处理的纤维素酶活性在堆肥前期随着物料中粗、细纤维的不断分解呈下降过程，至堆体温度高峰时形成最低点，随后逐渐升高且略高于初始酶活性值，于堆肥低温期纤维素酶活性又缓慢下降，整个过程与接种菌剂处理恰好相反，说明接种菌剂后完全改变了堆肥中原有纤维素酶的作用机理.

图4　堆肥过程中纤维素酶活性变化Fig.4　Dynamic of cellulase activity during composting

2.5蛋白酶活性的变化

堆肥物料中有机态氮降解为无机态氮的过程是由蛋白酶催化的，蛋白酶活性越高，则堆肥中可利用的无机态氮含量越丰富.其离体活性可参与环境氮循环.抑制蛋白酶活性的因素包括有机污染物、重金属以及较差的堆肥pH值，所以蛋白酶活性变化反映了堆肥环境质量的好坏程度.由图5可以看出，接种菌剂2处理的蛋白酶活性变化在堆肥初期大幅上升，形成酶活性高峰，峰值为20.36 mg/(g·d)，紧跟着出现谷值11.57 mg/(g·d)，峰谷值差异极大；第0～21天菌剂2处理的蛋白酶活性始终高于CK，表明接种菌剂2对堆肥蛋白酶活性的影响主要在堆肥升温期及高温期.菌剂1处理的蛋白酶活性于堆肥过程中变化相对较小，总体呈先升后降再升高的趋势.第3天后，CK处理的蛋白酶活性保持上升状态，且与堆体温度表现出极显著负相关性(r=-0.898，n=7，P<0.01)，说明温度对未接种菌剂处理的蛋白酶活性影响较大.

图5　堆肥过程中蛋白酶活性变化Fig.5　Dynamic of protease activity during composting

3讨论

堆肥过程是一个综合的、复杂的生化过程，酶活性大小是反映堆肥过程中矿质化过程和腐殖化过程生物化学进程的很好指标[28].堆肥发酵中不同生物化学反应的方向与强度，以及物料微生态环境对各种酶反应的胁迫与诱导均可通过相应酶活性变化来表现.在畜禽粪便堆肥过程中对不同堆肥时期的特征性酶的种类及其活性变化来反映堆肥演进过程的研究报道并不多.本试验中，接种菌剂处理与CK处理的过氧化氢酶活性于堆肥前后变化均较小，这与倪治华等[27]猪粪堆肥过程过氧化氢酶活性的变化不同，但与梁东丽等[28]及Marx等[29]的研究结果相一致，这可能与接种微生物数量及堆肥内环境引起微生物繁殖等因素紧密相关.尽管对过氧化氢酶活性这种变化的机理尚存疑问，但其与部分微生物的活动以及微生物种群之间的互作一定存在密切关联.在整个堆肥过程中接种菌剂处理的多酚氧化酶活性几乎都是低于CK处理，由于多酚氧化酶参与的是腐殖质中芳香族化合物的转化，与堆肥的腐熟度呈负相关[30]，因此接种两种菌剂均可加快堆肥腐熟进程.马瑛等[31]研究发现多酚氧化酶可表征腐殖质中芳香族有机化合物的转化，其酶活性在堆肥过程中逐渐降低，与堆肥的腐熟度成反比，这与本试验接种菌剂处理的研究结果一致.CK处理蛋白酶活性则表现出完全相反的变化，说明接入菌剂中分泌蛋白酶的微生物种群与原有微生物之间的互作协调能力较低.但根据多酚氧化酶与蛋白酶的变化趋势可认为，牛粪堆肥过程中有机物质首先发生氧化分解，随后才是含氮化合物的分解.此结果将为有机物发酵中有益微生物的定向培养与堆肥化学组分控制的定向发展提供理论依据[32-34].接种菌剂处理的纤维素酶活性在堆肥前期升高，而后下降再略有增加，此过程与谭小琴等[35]猪场废水堆肥纤维素酶活性的变化大致相同.纤维素酶是由多种微生物群体分泌所得，包括嗜热、中温与嗜冷微生物，堆肥进程中因菌剂的添加，延长了高温期，使中温与嗜冷微生物大量死亡或休眠，导致进入高温期不久纤维素酶活性大幅降低.

梁东丽等[28]在猪粪高温堆肥过程中对纤维素活性、蔗糖酶活性、脲酶、多酚氧化酶、脱氢酶及过氧化氢酶活性与堆肥高温期进行了相关性分析，结果表明过氧化氢酶活性、多酚氧化酶活性与堆肥温度成极显著正相关，但在本试验中，接种菌剂2处理的过氧化氢酶活性与温度是呈显著负相关性的，这可能与堆肥方式、接种菌剂种类的不同有关；而脲酶与堆肥温度成极显著负相关，这与本试验中接种菌剂2处理的研究结果相一致.

4结论

1)接种菌剂有效地增加了堆肥发酵温度，使高温期延长，且部分酶活水平与峰值(脲酶、纤维素酶、蛋白酶)得到明显提高.

2)堆肥有机物的分解与生成是在不同酶不同阶段参与下起作用的，因此酶活性的大小各时期也是有差异的.在整个堆肥过程中，接种菌剂后过氧化氢酶与脲酶活性变化基本一致，总体呈现上升趋势，但堆肥结束接种菌剂处理的脲酶活性是初始值的两倍以上；多酚氧化酶则与前两者相反，酶活性值逐渐降低，其中菌剂1处理于堆肥第7天出现峰值；纤维素酶高峰值出现在堆肥前期，中期活性较低，至后期活性又增加；接种菌剂2蛋白酶活性有高峰值产生，CK处理蛋白酶活性中后期稳定升高，菌剂1处理中后期酶活性始终低于CK处理，而菌剂2处理只于后期略低于CK处理.

3)在第21～49天接种菌剂纤维素酶活性与堆肥温度呈极显著负相关性(P<0.01)；第14～49天多酚氧化酶两者则呈显著正相关性(P<0.05).接种菌剂2过氧化氢酶、脲酶活性与堆体温度在不同阶段表现出显著(或极显著)相关性.CK处理的蛋白酶活性与堆体温度在第3～42天有极显著负相关性(P<0.01).说明接种菌剂能有效促进堆肥的生物化学进程，且菌剂2的作用较菌剂1显著.

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(责任编辑赵晓倩)

Effects of microbial agents on enzymes activities during cow manure composting

ZHANG Xiang-yong1,2,REN Jing1,MA Yan-xia1,YU Ji-hua1

(1.College of Horticulture,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China；2.Haikou College of Economics,Haikou 571127,China)

Abstract：【Objective】 This paper aims to clarify the dynamic changes of some enzymes activities in the thermophilic aerobic composting process after cow manure compost was inoculated,and reveal the biochemistry mechanism of thermophilic aerobic compost from the perspective of enzymology,which could provide theoretical reference basis for establishing comprehensive assessing index system and determining maturity threshold in cow manure compost.【Method】 Using the cow manure as the raw material of composts and two microbial agents were inoculated,analyzing change features of temperature and enzymatic activities of the thermophilic aerobic composts.【Result】 The results showed that adding microbial effectively enhanced the composting temperature,prolonged high temperature period and significantly increased urease,cellulose and protease activities and peaks,compared with those in CK treatment without inoculating microbial inoculum.In the composting process,activity changes of catalase and urease were basically consistent,which was higher in the anaphase than in the premetaphase.Polyphenol oxidase continuously declined and gradually was stable.In the prophase of composting,cellulose activity reached its peak.Proteinase activity in CK stably increased in midanaphase.【Conclusion】 Cellulose activity treated with microbial inoculum presented significantly negatively correlated (P<0.01) with compost temperature,however,the correlation between polyphenol oxidase and compost temperature was positive (P<0.05).Microbial inoculum 2 showed significant (or extremely significant) correlation between catalase,urease activites and pile temperature at different stages.Proteinase activity in CK was significantly negatively correlated with pile temperature (P<0.01),indicating that the enzymatic activities could act as biochemical assessment parameter for maturity in cow manure composting process.

Key words：enzyme activities;inoculant;temperature;cow manure compost

通信作者：郁继华，男，教授，博导，主要从事蔬菜生理和设施栽培方面的研究.E-mail:yujihua@gsau.edu.cn

基金项目：农业部行业专项“西北非耕地园艺作物栽培基质优化配制技术与产业示范”(201203001)；农业产业技术体系建设资金项目“国家大宗蔬菜产业体系”(CARS-25-C-07)；甘肃省级重大专项“玉米秸杆基质循环利用技术研究与示范”(1002FKDA038).

收稿日期：2015-03-15；修回日期：2015-05-28

中图分类号：S 144

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2016)03-0065-07

第一作者：张祥永(1982-)，男，硕士研究生，主要从事园林植物与观赏园艺的研究.E-mail:67644039@qq.com