燕麦Actin基因片段的克隆及序列分析

琚泽亮，赵桂琴，周向睿

(甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州　730070)



燕麦Actin基因片段的克隆及序列分析

琚泽亮，赵桂琴，周向睿

(甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州730070)

摘要：【目的】 克隆与分析燕麦肌动蛋白基因片段.【方法】 根据其他植物Actin基因的保守序列设计一对简并性引物，以燕麦叶片总RNA为模板，采用RT-PCR的方法扩增出Actin基因片段并克隆到PUCm-T载体，进而转化大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞.阳性克隆经PCR鉴定后进行测序.【结果】 扩增片段长678 bp，共编码225个氨基酸；所得序列与GenBank 中注册的Actin基因序列的同源性均在85%以上，与其他肌动蛋白的氨基酸序列的同源性达93%以上.【结论】 系统进化分析表明，扩增到的燕麦肌动蛋白基因与羊草、长穗偃麦草和黑麦草等植物的肌动蛋白基因亲缘关系最为密切.

关键词：燕麦；肌动蛋白；序列分析；系统进化分析

肌动蛋白(Actin)是真核生物中普遍存在的一种重要的古老蛋白质.在植物中，以肌动蛋白和微管蛋白为基础的细胞骨架与质膜相关或横贯细胞质，参与细胞分裂、分化、细胞内囊泡运输、细胞壁的生物合成、共生现象、胞吞胞吐作用以及膜的循环利用等众多生理过程，对生命体的进化有着深远的影响[1-3].肌动蛋白细胞骨架网络紧密地联系着其他重要的细胞器，发挥着不可替代的功能.作为管家基因，Actin在各种组织中表达恒定，是植物重要的内标参照之一，可用来比较来源不同的目的基因表达量的差异，以探明其他基因的表达模式及分子调控机制[4-5].同时，Actin基因在核苷酸和氨基酸水平上具有高度的保守性和同源性，这为研究不同物种之间的亲缘关系和分化时间提供了有利条件[6-7].

目前已在许多谷物和牧草中克隆到了Actin基因，如玉米[8]、水稻[9-10]、谷子[11]、大豆[12]、花生[13]、蒙古冰草[14]、紫花苜蓿[15]等；对它的相关研究也在进一步深入，如植物激动蛋白异型体[16]、肌动蛋白基因的功能[17]、肌动蛋白的信号转导、肌动蛋白聚合解聚机制[18-19]、植物细胞动态微丝骨架系统[20]等方面.

燕麦(Avenasativa)作为重要粮饲兼用作物，具有抗旱、耐冷、耐瘠薄等优良性状，是西北高寒牧区主要的一年生饲料作物；由于其籽实含有较高的蛋白质和脂肪以及水溶性纤维素，燕麦还是一种具有很高营养及保健价值的禾谷类作物.目前，燕麦的分子生物学研究尚处于起步阶段，基因组测序工作尚未完成，在对燕麦中很多有价值的基因进行研究时需要有内标参照物.同时，植物肌动蛋白的动力学变化是信号转导途径中至关重要的一步反应，来自多种信号转导途径的蛋白可通过直接作用于肌动蛋白来改变细胞的组织结构[18,21].这对燕麦众多生理过程发生机制的研究有重要价值.但是有关燕麦Actin基因的研究目前尚未见报道.鉴于此，本研究以燕麦幼苗叶片为试验材料，采用近缘克隆的方法克隆燕麦Actin基因片段，并进行序列分析，与其他高等植物肌动蛋白基因的相似性进行了比较，为燕麦分子生物学的后续研究打下基础.

1材料与方法

1.1试验材料

植物材料为2周龄的‘陇燕3号’幼苗，种子由甘肃农业大学草业学院提供.采集新鲜材料的叶片用液氮冷冻后，置于-80 ℃冰箱内保存备用.

1.2试验试剂

UNlQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒、M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、T-载体PCR产物克隆试剂盒、E.coliDH5α菌株、TaqDNA 聚合酶、dNTPs、PCR Buffer、MgCl2、Maker 均购自上海生工.其他生化试剂均为进口或国产分析纯.

1.3总RNA的提取

现在有一群热心的家长，他们组成班级家委会，定期为孩子们策划实践活动。有的家长发现孩子缺乏阅读兴趣，就组织阅读分享会，培养孩子的阅读兴趣。有的家长发现孩子的好词好句积累贫乏，就组织了成语接龙大赛，激发孩子们积累好词好句的热情。五年级综合性学习单元，遇到《遨游汉字王国》，家长们便带着孩子们走上街头寻找错别字，并整理分析，撰写探究报告。每一场活动对孩子们来说都是一次学习的机遇，家长就是这些机遇的制造者，为孩子们增添许多实践的机会，使孩子们在实践中享受学习的乐趣。

参考UNlQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒操作手册进行总RNA的提取，并根据实际情况稍作改进.用Gene Spec核酸检测仪检测RNA 质量浓度.将所得RNA样品于-80 ℃冰箱中保存备用.

1.4引物设计与合成

通过对冰草(GQ457302)、大麦(AY145451)、黑麦草(AY014278)、黑米(AY212324) 、水稻(AY212324)、小麦(AB181991)、羊草(HM623326)等几种近缘植物肌动蛋白基因的核苷酸序列进行同源性比较分析，依据同源性高和简并性低的原则，设计一对简并引物P1、P2，用于扩增燕麦Actin基因片段，推测目的片段的长度为678 bp.引物由上海生工合成.P1：5′-GCGAATACCATATCTGTWTT-3′；P2：5′-TTCCTCCGAATCTCGACACT-3′；其中W=A、T.

1.5RT-PCR扩增

cDNA 第一链的合成按照M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒操作手册进行.

PCR 扩增反应体系：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP(2 mmol/L)5 μL、MgC12(25 mmol/L)3 μL，TaqDNA polymerase(5U/1 μL) 0.5 μL、P1(10 μmol/L) 1 μL、P2(10 μmol/L) 1 μL、cDNA 4 μL和30.5 μL无菌水，总体积为50 μL.反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，51 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存.取10 μL PCR产物于1%的琼脂糖凝胶电泳，以检测目的条带.

1.6PCR产物的回收、转化、鉴定与测序

1.7序列的生物信息学分析

使用NCBI在线分析软件BLAST( www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 进行同源性比较；序列的翻译、分析及系统进化树的构建等在DNAMAN、MEGA4等生物软件上进行.

2结果与分析

2.1燕麦总RNA的提取

以燕麦幼嫩叶片为材料提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳分析结果(图1)显示，有3条明显的条带，28S rRNA的亮度约为18S rRNA的2倍，说明RNA有较好的完整性.Gene Spec核酸检测仪检测结果显示A260/A280、A260/A230值均大于1.8，表明RNA纯度较高，可以用于后续试验.

图1　燕麦叶片总RNA的琼脂糖凝胶电泳分析Fig.1　Electrophoresis analysis of total RNAisolated from oat leaves

2.2RT-PCR 扩增

用所得燕麦总RNA为模板进行反转录试验，获得第一链cDNA后，用简并引物P1、P2进行PCR扩增.对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果可见680 bp处有1条条带(图2).该条带大小与目的片段一致，且上下无杂带，可能是目的片段，有待进一步鉴定.

2.3阳性克隆的筛选鉴定

将可能为目的基因的片段回收纯化，然后与PUCm-T载体连接，转化大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞，用含有50 μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基进行蓝白斑筛选培养.从转化的平板上随机挑取4个阳性克隆提取质粒，进行PCR扩增，得到的片段大小约为678 bp(图3)，与RT-PCR结果一致，鉴定为阳性克隆，将其送往上海生工进行测序.

M：Marker ；1-2：PCR产物.图2　燕麦Actin基因PCR产物Fig.2　PCR product of Actin from oat cDNA

M ：Marker；1-4：为阳性克隆.图3　阳性克隆的PCR检测结果Fig.3　PCR identifying of positive clone

2.4测序结果及序列分析

将阳性克隆进行双向测序，得到一段678 bp的cDNA序列，编码225个氨基酸(图4).将该基因片段与GenBank数据库进行核苷酸同源性比较分析，Blast结果显示：该片段与其他肌动蛋白基因的核酸序列同源性均很高，在85%以上.与小麦(GQ339780)和长穗偃麦草(KF981729)的同源性为最高，达96%.氨基酸分析结果显示同源性达93%以上.这证明了所得片段即为燕麦肌动蛋白基因片段.将该基因命名为AsACT，同时将序列提交至GenBank，登录号为KP257585.

根据GenBank中肌动蛋白氨基酸序列数据推测出燕麦Actin基因的氨基酸序列片段，并与GenBank数据库进行氨基酸多重比较.结果显示其保守氨基酸为201个，非保守氨基酸为24个，表明克隆所得片段为肌动蛋白基因的高度保守区域，也进一步证实了肌动蛋白是一种高度保守的蛋白.

下划线为引物序列.图4　燕麦Actin基因cDNA的核苷酸序列片段与推测的氨基酸序列Fig.4　Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of Actin from oat

2.5常见作物与牧草肌动蛋白家族系统进化分析

根据Blast结果，选取我国常见的、同源性较高的作物与牧草，下载它们的肌动蛋白序列，包括羊草(Leymuschinensis，ADK98519)、长穗偃麦草(Lophopyrumelongatum，AHL58686)、黑麦草(Loliumperenne，AAG43040)、水稻(sativaJaponicaGroup，AAO62546)、黑米(sativaJaponicaGroup，AAO62546.1)、玉米(Zeamays，NP 001159156)、冰草(Agropyroncristatum，ACV71031)、大麦(Hordeumvulgare，AAN59956)、小米(Setariaitalica，AAG10041)、花生(Arachishypogaea，ABI79455)、黄豆(Glycinemax，ACU27913)、马铃薯(Solanumtuberosum，ACU27904)、豌豆(Pisumsativum，ACU27909)、紫花苜蓿(Medicagosativa，AFB83349)、油菜(Brassicanapus，AAD03741)、蒙古冰草(Agropyronmongolicum，ACL36421)和小麦(Triticumaestivum，BAD23897).用MEGA5.1生物软件中的ClustalW进行序列比对，然后采用Neighbor-Joining算法构建系统进化树(图5)，参数为默认值.

图5　常见作物与牧草肌动蛋白的分子进化树Fig.5　Phylogenetic analysis of Actin proteins

结果表明，燕麦肌动蛋白与羊草、长穗偃麦草和黑麦草的亲缘关系最为密切，其次为水稻、玉米等禾本科作物，它们处于同一个分支上.燕麦分为皮燕麦和裸燕麦两种，本研究采用的‘陇燕3号’为皮燕麦，主要用作饲草，图5显示与其亲缘关系最为密切的3种植物皆为牧草.同时，图中还反映出系统分类学上同一科的植物，往往被聚类在一起，亲缘关系较近，如豆科的豌豆、紫花苜蓿，禾本科的蒙古冰草和小麦.这些都暗示肌动蛋白基因的进化存在种属特性，处于同种生态位的植物其功能基因在进化中往往亲缘关系密切.而茄科的马铃薯与豆科植物聚为一类，十字花科的油菜与禾本科植物聚为一类，体现了植物肌动蛋白进化的复杂性，这可能与该基因功能的复杂性有关[22].也进一步证明了肌动蛋白的高度保守性，对其完成众多细胞功能、承受选择压力具有重要的生物学意义.

3讨论

高等植物肌动蛋白是单一多肽链的球状蛋白，由375～377个氨基酸组成，分子质量为42 ku，广泛存在于植物的各种组织器官中.与其功能保守性相对应的是其氨基酸序列具有高度的保守性和同源性[10].本研究所得序列与GenBank 中注册的Actin 基因序列的同源性均在85%以上，与其他肌动蛋白的氨基酸序列的同源性达93%以上，也再次证明了这一点.蛋白质进化速率主要取决于功能上的需要或自然选择压力，而较少受氨基酸组成的影响[23].李园莉等[11]在比较了多种植物肌动蛋白基因所编码的氨基酸变化的位置和分布之后，提出肌动蛋白氨基酸序列有大量更换替代，但是序列的亲水、疏水特性有高度的相似性.这反映出肌动蛋白在三级结构上具有强烈的抗选择压力，为保障细胞生命活动提供了坚实的结构基础[6]，也说明了肌动蛋白在植物生命活动中功能的重要性.以植物肌动蛋白为主形成的动态微丝骨架系统已成为植物细胞生物学研究领域的热点之一[20].本试验结果为燕麦肌动蛋白后续功能研究提供了有力参考，丰富了燕麦细胞骨架领域的研究资料.

燕麦是一种粮草兼用型1年生饲料作物，具有适应性强、产草量高、营养价值高、适口性好、经济效益高等特点[24].但是，燕麦的遗传背景和分子生物学研究基础比较差，基因组测序尚未完成，在研究燕麦多种优良抗逆基因及其他遗传特性时需要一个良好的基因作为内参[25].肌动蛋白基因高度的保守性使其成为一种很好的植物基因研究内标之一.本研究选取皮燕麦为材料，克隆到的肌动蛋白基因全长678 bp，序列长度能够满足不同长度扩增片段引物设计、不同PCR反应程序的需要，可为燕麦其他基因表达模式及调控机制的研究提供参考；同时，不足之处是未与裸燕麦做比较，进一步的研究正在进行中.

肌动蛋白是从分子水平研究生物系统进化的一个很好的材料.本研究中，常见作物与牧草肌动蛋白家族系统进化分析结果反映了各植物间的亲缘关系，使我们能够了解各种生物进化的进程[11]，研究燕麦的起源与进化，促进作物种质资源的科学利用与管理.由于植物肌动蛋白基因成员组成的广泛性和分化性，当前已知的肌动蛋白基因仅为植物肌动蛋白家族的一部分，根据肌动蛋白基因序列构建的系统树还只是基因的分子进化树，虽然在区分亲缘关系较远的物种时具有一定的参考价值，但对亲缘关系较近的物种则无法做出精确衡量.完善的物种进化树有待于今后更多肌动蛋白基因的发现和系统进化分析方法的改进和完善[26-27].随着研究的深入，越来越多的植物肌动蛋白基因被克隆出来，对它的研究会更广泛而深入，进而促进肌动蛋白基因在各种作物研究和改良上的应用，为农业增产增收提供保障.

4结论

采用RT-PCR的方法进行燕麦Actin基因片段的克隆.获得了一段长678 bp的燕麦肌动蛋白cDNA序列，编码225个氨基酸；所得序列与GenBank 中注册的Actin基因序列的同源性均在85%以上，与其他肌动蛋白的氨基酸序列的同源性达93%以上.系统进化分析显示其与羊草、长穗偃麦草和黑麦草等植物的肌动蛋白基因亲缘关系最为密切.

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(责任编辑赵晓倩)

Cloning and sequence analysis ofActingene fragment fromAvenasativa

JU Ze-liang,ZHAO Gui-qin,ZHOU Xiang-rui

(College of Pratacultural Science,Gansu Agricultural University，Key Laboratory of Grassland Ecology System,Ministry of Education,Sino-U.S.Centers for Grazingland Ecosystem Sustainability,Lanzhou 730070,China)

Abstract：【Objective】To clone and analyze theActingene fromAvenasativa.【Method】 Degenerate primers were designed based on the conserved sequences of the actin genes from other plants.Total RNA was extracted from the leaves ofA.sativa.Actin gene fragment was obtained by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and cloned into PUCm-T vector.The positive clone identified by PCR was sequenced.【Result】 The amplified fragment fromA.sativacontains 678 bp,encoded a protein of 225 amino acids.Homology comparison with other plants actin gene sequences in the GenBank showed that it shared over 85% nucleotide sequence homology and 93% amino acid sequence homology with other plants actins.【Conclusion】Actingene ofA.sativahas an intimate genetic relationship withActingenes ofLeymuschinensis,LophopyrumelongatumandLoliumperenne.

Key words：Avenasativa;Actin;sequence analysis;phylogenetic analysis

通信作者：赵桂琴，女，教授，博士生导师，研究方向为草种质资源及育种.E-mail：zhaogq@gsau.edu.cn

基金项目：农业部牧草种质资源保护项目(2013014)；甘肃高校基本科研业务费项目(2012009).

收稿日期：2015-03-17；修回日期：2015-04-21

中图分类号：S 512.6

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2016)03-0037-06

第一作者：琚泽亮(1991-)，男，硕士，研究方向为草种质资源.E-mail：juzliang@126.com