肉牛血浆和尿液中莱克多巴胺残留消除规律分析

梁晓维，年芳，张军民，赵青余，张凯，汤超华，李发弟

(1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州　730070；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部华北动物遗传资源与营养科学观测实验站，北京　100193；3.中国农业科学院-世界农用林业中心农用林业与可持续畜牧业联合实验室，北京　100193)



肉牛血浆和尿液中莱克多巴胺残留消除规律分析

梁晓维1,2，年芳1，张军民2,3，赵青余2,3，张凯2,3，汤超华2,3，李发弟1

(1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州730070；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部华北动物遗传资源与营养科学观测实验站，北京100193；3.中国农业科学院-世界农用林业中心农用林业与可持续畜牧业联合实验室，北京100193)

摘要：【目的】 研究莱克多巴胺在肉牛血浆和尿液中的残留消除规律.【方法】 选取3头中国‘西门塔尔’杂交肉牛，连续饲喂莱克多巴胺28 d，给药剂量2.01 mg/(kg·d)，采集给药第1、7、14、21、28 d和停药第3、7、14、28 d血浆和尿液样品,采用高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS-MS)检测血浆和尿液中莱克多巴胺含量.【结果】 血浆与尿液中莱克多巴胺含量均在给药7 d达到峰值，血浆中残留量为(6.55±1.93)ng/mL，未酶解尿液中残留量为(8 402.03±1 307.09)ng/mL.峰值之后莱克多巴胺含量开始下降，停药后下降迅速，停药3 d时血浆中残留量为(0.60±0.01)ng/ mL，未酶解尿液中残留量为(1 334.93±25.74)ng/mL，停药28 d时血浆中未检测到莱克多巴胺，而未酶解尿液仍可检测到(5.77±0.10)ng/mL；酶解后尿液中莱克多巴胺含量显著高于酶解前(P<0.05).【结论】 与血浆相比，肉牛尿液更适合作为莱克多巴胺的监管靶标.

关键词：肉牛；莱克多巴胺；血浆；尿液；残留

β-受体激动剂是一类具有肾上腺素功能的苯乙醇胺类化合物[1]，俗称“瘦肉精”.莱克多巴胺作为其中一种，又名雷托帕明、培林等，对动物具有促生长作用，能够促进蛋白合成，降低脂肪沉积量，提高胴体瘦肉率，起到营养重分配的作用[2-4].然而“瘦肉精”能够在动物体内残留，人食用后轻则引发头晕、恶心、肌肉震颤、心率失常等症状，重则有可能引起恶性肿瘤[5-7].美国、日本和澳大利亚等国家批准莱克多巴胺作为动物饲料添加剂使用，而早在2002年我国农业部就明确规定禁止莱克多巴胺用作动物饲料和饮水添加剂[8].但是，我国仍有不法商贩为了谋取暴利而在动物生产过程中非法使用，由于“瘦肉精”而引发的食物中毒事件仍屡屡发生.

我国监管部门常将血浆和尿液作为“瘦肉精”的监管靶标，莱克多巴胺在血浆和尿液中的残留时间决定其作为监测靶标的可靠性，目前国内外关于莱克多巴胺在动物血浆和尿液中的残留消除规律研究较少，肉牛血浆和尿液中莱克多巴胺残留消除数据缺乏.因此，本试验选取3头中国‘西门塔尔’杂交肉牛，连续饲喂莱克多巴胺28 d，以研究其在肉牛血浆和尿液中的残留消除规律，为监管部门提供数据支撑，完善对“瘦肉精”在反刍动物上的监管.

1材料与方法

1.1试剂和仪器

莱克多巴胺标准品 (德国Sigma-Aldrich公司) 纯度 94.05%，莱克多巴胺-D3内标 (加拿大C/D/N Isotopes公司)纯度98.5%，莱克多巴胺原药 (用于动物试验)纯度93%，由中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所提供，β-葡萄糖苷酸酶 (德国Merck Chemical公司)，甲醇、甲酸、乙腈均是色谱级，其他化学试剂均为分析纯.

Waters高效液相色谱串联质谱仪 (Xevo-TQ)，固相萃取柱 (Mcx 60 mg，3 mL)，0.2 μm针筒式微孔过滤膜，24孔固相萃取仪等.

1.2试验设计及饲养管理

选取体况良好的中国‘西门塔尔’杂交肉牛3头 (265±14) kg，预饲期7 d，给药期28 d，休药期28 d，给药剂量2.01 mg/(kg·d)，根据初始体质量计算每日莱克多巴胺用药量，将所称药物拌入精料中于给药期早上7∶00一次性饲喂.试验在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所肉牛试验基地进行，试验牛采取舍饲拴系饲喂，预饲期前打耳号，正式期前称体质量，其他条件按照养殖场的饲养管理进行.

1.3样品采集

试验开始前采集空白血浆、尿液样品，开始后分别在给药第1、7、14、21、28 d和停药第3、7、14、28 d采集血浆和尿液样品.血样于给药前通过颈静脉采集，经3 500 r/min离心10 min后分离血浆样品，-20 ℃保存待检.尿样采用集尿袋装置收集24 h尿液，混匀后取20 mL，-20 ℃保存待检.

1.4样品提取

样品的提取过程主要参考Tang等[9].取血浆或尿液样品1 mL置于10 mL离心管 (高浓度尿液在提取时稀释相应倍数后取1 mL)，加入50 μL内标溶液 (5 ng/mL，内标用甲醇溶液稀释)，加入3 mL乙酸铵缓冲液 (pH 5.2)，添加10%高氯酸溶液500 μL沉淀蛋白，涡旋混匀1 min，8 000 r/min离心5 min，上清液备用.固相萃取柱先用3 mL甲醇活化和3 mL 0.1%甲酸溶液平衡，将上述处理后的样品上清液全部过柱，然后用3 mL 0.1%甲酸溶液、3 mL甲醇淋洗，真空抽干.用3 mL 5 %氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，50 ℃下氮气吹干.残余物用1.0 mL流动相 (0.1甲酸溶液∶乙腈=9∶1)复溶后，涡旋混匀1 min，0.2 μm微孔滤膜过滤，上机测定.

酶解尿液提取时所加内标用乙酸铵缓冲液稀释，防止有机溶剂破坏酶的活性，在加入3 mL乙酸铵缓冲液后添加β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶50 μL，37 ℃酶解16 h，然后添加10%高氯酸溶液500 μL沉淀蛋白，其余步骤同上.

1.5色谱质谱条件

色谱柱为Acquity UPLC BEH C18 (50 mm×2.1 mm，粒径1.7 μm)，柱温40 ℃，进样量5 μL，流动相为0.1%甲酸溶液 (A)和乙腈 (B)，流速均为300 μL/min.使用Xevo-TQ三段四级质谱仪，离子源为ESI+，毛细管电压3 kV，锥孔电压29 V.离子源和去溶剂化温度分别为150 ℃和 350 ℃，氮气流量为为600 L/h.监测模式：多重反应监测(MRM)，莱克多巴胺母离子 m/z 302.0对应子离子m/z107.1、m/z 164.1，莱克多巴胺-D3内标母离子 m/z 305对应子离子 m/z 124.1、m/z 167.2.

1.6数据处理

2结果与分析

2.1方法验证

莱克多巴胺浓度为0.5～40 ng/mL范围内色谱峰面积与浓度呈线性相关，所得标准曲线为y=997.89x(R2=0.998 6).肉牛血浆中莱克多巴胺的检测限 (LOD)为0.05 ng/mL，定量限(LOQ)为0.2 ng/mL.肉牛尿液中莱克多巴胺的LOD为0.3 ng/mL，LOQ为2 ng/mL.血浆和尿液空白样品添加回收率及变异系数见表1.血浆和尿液中莱克多巴胺标准、莱克多巴胺-D3内标和总离子流图 (TIC)分别见图1-2.

表1　血浆和尿液样品添加回收率和变异系数

2.2肉牛血浆中莱克多巴胺残留消除规律

给药期及停药期肉牛血浆中莱克多巴胺残留消除规律见图3.给药后随时间推移血浆中莱克多巴胺残留量逐渐增加，给药1 d莱克多巴胺残留量为(4.00±0.47) ng/mL，给药7 d时达到峰值 (6.55±1.93) ng/mL)，随后开始下降，给药28 d血浆中残留量为(3.43±0.59) ng/mL.而停药后血浆中莱克多巴胺残留量迅速下降，在停药3 d已下降至(0.60±0.01) ng/mL，停药7 d和14 d时残留量分别为(0.31±0.07)、(0.30±0.03) ng/mL，停药28 d时未检测到莱克多巴胺.

2.3肉牛尿液中莱克多巴胺残留消除规律

给药期及停药期酶解前后肉牛尿液中莱克多巴胺残留消除规律见图4.肉牛未酶解尿液中莱克多巴胺残留量随着给药时间的延长而逐渐增加，给药1 d时含量为(4 211.0±1 572.18) ng/mL，给药7 d达到峰值 (8 402.03±1 307.09)ng/mL，随后开始下降，给药28 d时含量为(3 630.62±825.21)ng/mL，停药后下降迅速，停药7 d时尿液中莱克多巴胺已下降至(55.66±9.08) ng/mL，而在停药28 d时尿液中仍可检测到(5.77±0.10) ng/mL.

A：5 ng/mL莱克多巴胺-D3内标单离子色谱图；B：5 ng/mL莱克多巴胺标准品单离子色谱图；C：总离子流图：1 mL血浆样品中的莱克多巴胺.图1　血浆样品色谱图Fig.1　Single-ion chromatograms of specimen in plasma

A：5 ng/mL莱克多巴胺-D3内标单离子色谱图；B：5 ng/mL莱克多巴胺标准品单离子色谱图；C：总离子流图：1 mL肉牛尿液样品中的莱克多巴胺图2　尿液样品色谱图Fig.2　Single-ion chromatograms of specimen in urine

酶解后尿液中莱克多巴胺含量显著高于酶解前(P<0.05)，但残留消除趋势与酶解前相似，酶解后尿液在给药1 d时莱克多巴胺含量为(19 325.57±5 482.17) ng/mL，给药7 d时达到峰值 (24 014.32±3 539.45) ng/mL，药28 d含量为(7 539.917±1 130.82) ng/mL，停药后迅速下降，在停药3 d时已下降至(1 431.69±347.64) ng/mL，而在停药28 d时酶解尿液中仍有(13.41±0.96) ng/mL莱克多巴胺.

图3　肉牛血浆中莱克多巴胺残留消除规律Fig.3　Regularity of residue degradation ofractopamine in plasma of cattle

图4　酶解前后肉牛尿液中莱克多巴胺残留消除规律Fig.4　Regularity of residue degradation ofractopamine in urine before and afterhydrolysis with β-Glucuronidase

3讨论

3.1肉牛血浆中莱克多巴胺残留消除规律

目前，国内外关于莱克多巴胺在动物血浆中的残留消除规律报道很少，早期研究报道猪饲喂30 mg/kg莱克多巴胺4 d，停药0、1 d时血液中的残留量分别为40、10 ng/mL，停药2 d时未检测到，LOD为10 ng/mL[10].Qiang等给长白猪连续口服饲喂莱克多巴胺28 d，结果发现在给药7 d时血浆中有5.1～9.6 ng/mL的莱克多巴胺残留，给药14 d时残留量达到8.4～9.9 ng/mL，而在给药28 d时残留量低于1 ng/mL，停药后未检测到[11].Tang等研究显示干乳期奶牛经瘤胃灌服2.01 mg/(kg·d)莱克多巴胺5 d，给药期血浆中莱克多巴胺随时间延长呈增长趋势，给药5 d时残留量为6.10 ng/mL，而停药后开始下降，停药3 d时为0.69 ng/mL，停药5 d已检测不到[9].本试验结果与以上研究结果相似，在给药期肉牛血浆中莱克多巴胺残留量随时间延长而逐渐增加，给药7 d达到峰值(6.55 ng/mL)，随后开始下降，停药后快速消除，停药7 d到停药14 d时莱克多巴胺含量0.3 ng/mL左右.由于给药时间、剂量、方式和动物种类的不同，以及仪器检测限的不同，导致残留时间的差异，本试验在肉牛血浆中莱克多巴胺的残留时间要长于以上研究.

3.2肉牛尿液中莱克多巴胺残留消除规律

莱克多巴胺在动物尿液中残留消除规律已有相关报道，但肉牛相关研究较少.Pleadin等研究结果表明，给猪连续饲喂28 d(0.1 mg/(kg·d))莱克多巴胺后，发现在给药1 d尿中莱克多巴胺含量为0.5 ng/mL，随着给药时间的延长，莱克多巴胺的含量逐渐增加，在给药25 d时达到峰值，随后开始下降，停药7 d尿中仍能检测到莱克多巴胺[12].Qiang等研究结果表明，猪饲喂18 mg/kg莱克多巴胺28 d，给药7 d尿中莱克多巴胺含残留量最高(650.1 ng/mL)，随后开始下降，在停药14 d检测不到残留[11].相似的研究中，同样饲喂18 mg/kg的莱克多巴胺，饲喂两周后检测尿中莱克多巴胺的残留情况，结果发现停药1 d猪尿中莱克多巴胺的含量，随着停药时间的延长尿中莱克多巴胺的残留逐渐减少，但在停药28 d尿液中仍能检测到莱克多巴胺[13].Smith等研究了莱克多巴胺在绵羊和肉牛尿液中残留规律，绵羊给药剂量0.373 mg/(kg ·d)，给药7 d，肉牛给药剂量0.432 mg/(kg·d)，给药8 d，结果显示在给药5 d时尿中莱克多巴胺均达到峰值，绵羊酶解尿液在停药7 d时仍有(178±78) ng/mL，肉牛尿液在停药7 d时低于LOQ(LOQ=50 ng/mL)[14-16].Tang等报道干乳期奶牛给药5 d，给药期间尿中莱克多巴胺含量逐渐增加，停药后下降，停药14 d仍可检测到[9].本试验中莱克多巴胺在尿液中的残留规律与以上研究结果相似，残留量随给药时间的延长而逐渐增加，给药7 d达到峰值，随后开始下降，然而由于给药期、给药剂量及动物种类的不同，莱克多巴胺在尿液中达到峰值的时间及残留时间存在一定的差异，本试验停药28 d肉牛尿液中仍可检测到莱克多巴胺 (以上尿液中莱克多巴胺残留量均为酶解前含量).

莱克多巴胺进入机体后可代谢形成葡萄糖苷酸或硫酸轭合物[17]，研究发现猪体内主要有3种莱克多巴胺代谢物[18]，而在肉牛体内有四种莱克多巴胺代谢物[19]，因此本试验分别测定了酶解前后尿液中莱克多巴胺的含量，结果显示酶解后尿液中莱克多巴胺残留量显著高于酶解前(P<0.05)，这与其他文献的报道一致[9-16].尿液中排出的莱克多巴胺既包括原药又含有其轭合物[20]，经β-葡萄糖苷酸酶酶解后莱克多巴胺轭合物转化为游离态，从而增加了酶解尿液中莱克多巴胺的含量[21].

3.3肉牛血浆和尿液中莱克多巴胺残留消除规律对比

莱克多巴胺进入动物机体后通过胃肠道吸收进入血液循环[22]，然后经过肾脏的浓缩过滤随尿液排出体外[23]，尿液是莱克多巴胺排出的主要途径[24].本试验中尿液与血浆相比，血浆和尿液中莱克多巴胺在同一时间点达到峰值，同时尿液中的残留量显著高于血浆，并且莱克多巴胺在尿液中的残留时间较长，这与Qiang等[11]的研究一致.本试验发现肉牛血浆中莱克多巴胺在停药7 d和停药14 d残留量均在0.3 ng/mL左右，而市面上莱克多巴胺快速检测试剂盒LOD大多在0.3 ng/mL左右，若用血浆作为靶标检测时易造成假阴性结果，因此在对莱克多巴胺非法使用的监管过程中，应选用尿液作为快速检测靶标，由于在进行快速检测时主要针对原药形式，因此应结合高效液相色谱串联质谱法进一步检测其酶解后含量，以确保动物性食品的安全.

4结论

本试验结果显示莱克多巴胺在肉牛血浆和尿液中的残留存在峰值，尿液中莱克多巴胺残留量显著高于血浆，且残留时间长于血浆；酶解后尿液中莱克多巴胺含量显著高于酶解前，莱克多巴胺以原药和轭合物两种形态存在于尿液中.在肉牛监管方面选用尿液作为快速检测靶标的同时结合高效液相色谱串联质谱法进一步检测其酶解后含量，以确保肉类食品的安全.

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(责任编辑李辛)

Elimination of ractopamine residues in beef cattle plasma and urine

LIANG Xiao-wei1,2,NIAN Fang1,ZHANG Jun-min2,3,ZHAO Qing-yu2,3,ZHANG Kai2,3,TANG Chao-hua2,3,LI Fa-di1

(1.College of Animal Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070，China；2.Institute of Animal Science,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Scientific Observing and Experiment Station of Animal Genetic Resources and Nutrition in North China,Ministry of Agriculture,Beijing 100193，China；3.CAAS-ICRAF Joint Laboratory on Agroforestry and Sustainable Animal Husbandry,Institute of Animal Science,Beijing 100193,China)

Abstract：【Objective】 Eliminating rule of ractopamine residue in plasma and urine of beef cattle was investigated.【Method】 Three Chinese Simmental cross beef cattle were continuously fed ractopamine in a dose of 2.01 mg/(kg·d) weight /day for 28 days.Plasma and urine samples were collected on treated days of 1,7,14,21,28 and withdrawal days of 3,7,14,28 d，The ractopamine concentrations were determined by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS) method.【Result】 The ractopamine concentrations in plasma and urine peaked on the 7 th treated day,and the residue in plasma and urine was (6.55±1.93) and ( 8 402.03±1 307.09) ng/ mL,respectively.Ractopamine residues gradually decreased after the peak value and dropped rapidly after stopping treatment.After drug withdrawal for 3 days,the concentrations of parent ractopamine in plasma and urine were (0.60±0.01) and (1 334.93±25.74) ng/mL,respectively.Parent ractopamine residues was (5.77±0.10) ng/mL in urine and not detected in plasma after withdrawal for 28 days.After the hydrolysis of conjugates,ractopamine content in urine was significantly higher than that before hydrolysis (P<0.05).【Conclusion】 Urine is a more favorable target for supervision before slaughter compared to plasma.

Key words：beef cattle;ractopamine;plasma;urine;residues

通信作者：年芳，女，副教授，主要从事动物营养与饲料科学的研究.E-mail:nianf@gsau.edu.cn

基金项目：中国公益性行业(农业)科研专项(201203088)

收稿日期：2015-04-16；修回日期：2015-04-27

中图分类号：S 823.9+2

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2016)03-0008-07

第一作者：梁晓维(1988-)，女，硕士研究生，研究方向动物营养与饲料学.E-mail:liangxw680@126.com

张军民，男，研究员，主要从事动物营养与畜产品质量安全的研究.E-mail:zhjmxms@sina.com