弓形虫CDPK5基因多克隆抗血清的制备及功能鉴定*

钟亮尹，刘思敏，曾智华，徐晓松，卢汉威，周文超，黄演婷，卢景辉，陈思聪

(广东药科大学附属第一医院检验科，广州 510080)



弓形虫CDPK5基因多克隆抗血清的制备及功能鉴定*

钟亮尹，刘思敏，曾智华，徐晓松，卢汉威，周文超，黄演婷，卢景辉，陈思聪

(广东药科大学附属第一医院检验科，广州 510080)

[摘要]目的筛选弓形虫(Tg)CDPK5基因序列的免疫多肽，将合成多肽免疫新西兰白兔制备多抗血清，并对其功能进行鉴定。方法利用生物信息学的方法分析确定Tg CDPK5序列免疫多肽，再用合成的多肽免疫新西兰白兔制备多抗。收集多抗血清，酶联免疫吸附测定(ELISA)测定多抗滴度，蛋白免疫印迹法(Western blot)鉴定免疫活性，免疫荧光实验分析Tg CDPK5的亚细胞定位。结果通过生物信息学分析，选择Tg CDPK5序列N端一段长17 bp的多肽序列作为免疫多肽；用合成的多肽免疫兔子，成功获得多抗血清。ELISA测定多抗血清效价为1∶640 000；Western blot证明该多抗血清能特异性识别Tg CDPK5(75.4×103)条带；免疫荧光实验结果表明，该多抗能特异性识别弓形虫内源Tg CDPK5蛋白。结论研究根据Tg CDPK5序列信息的分析，获得Tg CDPK5序列免疫多肽，并制备兔源多克隆抗体。

[关键词]弓形虫;CDPK5基因;多抗血清;免疫荧光

弓形虫(toxoplasma gondii,Tg)是一种顶复门寄生虫，可感染几乎所有哺乳动物和鸟类，引起人兽共患的弓形虫病[1]。由于其传播能力极强，对畜牧业和公共卫生安全的危害极大。全世界大约有1/3的人感染Tg[2]，但多数为隐形感染。在免疫力低下或免疫缺陷患者中，这种潜伏性感染可被激活，进而引起严重的损害；孕妇感染Tg可引起流产、死胎或畸形；另外，30%～70%患有先天性弓形虫病的新生儿会继发视网膜病变[3]。目前，治疗弓形虫病的经典药物仍以乙胺嘧啶联合磺胺类药物为主，但其缺点是疗程长达1年以上，具有不良反应，而且仅对Tg滋养体有抑制效果，不能治愈弓形虫病[4]；阿奇霉素是惟一对包囊和速殖子均有一定作用的药物，半衰期长，不良反应较少，但长期服用会产生细胞毒性和耐药性。因此，面对不断增长的Tg感染患者和Tg抗药性的产生，开发新的抗Tg药物不但至关重要而且面临着急迫性。

钙依赖的蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase，CDPK)家族是一类钙离子(Ca2+)结合的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，对Ca2+信号转导通路下游元件的调控具有重要作用。Ca2+作为Tg细胞内多种生理生化过程的重要环节，其水平的异常直接导致细胞功能的异常。研究发现，Tg CDPKs可参与调控Tg入侵宿主细胞、蛋白分泌、运动，及分化等生理过程[5]。除此之外，一些CDPKs具有良好的免疫原性，不仅能刺激淋巴细胞增殖，还能诱导机体产生特异性抗体，被认为是研发针对顶复门原虫新型生物制剂的候选基因[6]。

目前研究发现，Tg CDPKs基因大约有11个。已经被证实的有CDPK1、CDPK2、CDPK3及CDPK4[7]。进一步研究发现,Tg CDPK5可能与Tg的细胞毒力、侵袭力相关[8]。然而关于Tg CDPK5对Tg生长、毒力、侵袭力、微线体分泌，以及水甘油渗透性的调控作用报道较少。为了研究Tg CDPK5对Tg的生物学功能，Tg CDPK5蛋白多抗是实验研究的重要材料之一。本研究拟通过经典多抗制备方法获得兔抗Tg CDPK5多克隆抗体，并通过相应检测方法，确定该多抗的效价以及特异性，旨在为Tg CDPK5基因后续研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1Tg虫株Tg虫株为刚地Tg ME49株(Ⅱ型虫株)，液氮保种，复苏后腹腔接种小鼠传代。

1.1.2主要试剂免疫多肽由广州瑞博奥生物科技有限公司合成；马来酰亚胺活化的BSA、KLH偶联试剂盒(MBK1)、十二烷基硫酸钠(SDS)、过硫酸铵、四甲基乙二胺(TEMED)、脱脂奶粉为Sigma公司产品，多聚甲醛，30%丙烯酰胺购自弗德生物，弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、购自Roche公司。辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG抗体购自Santa Curz，蛋白质Marker购自Fermentas公司；PVDF膜购自BioRad公司，TMB底物显色液、Alexa Fluor488标记的羊抗鼠IgG抗体购自Invitrogen，蛋白免疫印迹法(Western blot)底物显色液购自Thermo fisher Scientific，BSA、TritonX-100购自碧云天生物技术研究所，其他试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1Tg CDPK5免疫多肽的获得根据NCBI中TgCDPK5序列(NCBI序列号：XM_002366128.1)，使用TMHMM软件和BCPREDS Server 1.0软件对TgCDPK5的跨膜区和B细胞线性抗原表位进行预测。选取具有高度抗原性的非跨膜区保守序列，并委托广州瑞博奥生物科技有限公司合成多肽。

1.2.2多克隆抗体的制备与纯化合成的多肽用试剂盒偶联BSA或KLH。将偶联多肽溶于无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中，以等体积的比例分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂进行充分乳化作为免疫原。将获得的免疫原免疫新西兰大白兔(雄性，1.5 kg)。经背部皮下多点注射，第3次免疫3 d后，耳缘静脉取血，测抗体效价。待血清效价达到一定值后，常规心脏取血，收集血清于-80 ℃保存备用。用结合缓冲液稀释多抗血清后于0.45 μm滤膜过滤，加样到IgG亲和层析柱，流速1 mL/min至基线，用洗脱缓冲液(100 mmol/L甘氨酸-HCl，pH 2.5)洗脱后，收集洗脱峰为纯化的多克隆抗体。取5 μL进行十二烷基-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，观察纯化后结果。

1.2.3多克隆抗血清效价鉴定采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测抗血清效价：每孔100 ng包被原于4 ℃包被过夜，第2天用1%BSA-PBS封闭1 h；洗涤后，加入梯度稀释的多克隆抗血清孵育2 h，以正常兔血清作为阴性对照。洗涤后，加入1∶10 000稀释的HRP标记羊抗兔IgG孵育1 h，TMB显色。用ELISA检测仪测定450 nm处的吸光度(A)值。

1.2.4多抗血清免疫活性鉴定样本为1×107数量的纯化的Tg，Tg用人包皮成纤维细胞(HFF-1)培养，用3 μm滤膜纯化。超声裂解虫体后，取上清液经12%SDS-PAGE、转膜、封闭后，以免疫前正常兔血清为阴性对照，制备的Tg CDPK5抗血清为一抗，羊抗兔HRP-IgG为二抗，ECL显色，观察结果。

1.2.5免疫荧光实验分析Tg CDPK5的亚细胞定位以免疫前正常兔血清为阴性对照，取纯化的Tg涂于激光共聚焦专用培养皿中，室温晾干。加入4%多聚甲醛固定10 min，PBST洗涤3次，每次5 min。加入0.1%Triton-X-100，透化15 min，PBS洗涤3次，每次5 min。加入PBS固定30 min后，加入制备的Tg CDPK5抗血清作为一抗1∶100稀释，孵育1 h。PBS洗涤3次，每次5 min。1∶1 000的比例加入二抗(Alexa Fluor488标记的羊抗鼠IgG)，孵育1 h，避光，室温。PBS洗涤3次。加入DAPI染色10 min，PBST洗涤1次，上机照相。

2结果

2.1Tg CDPK5免疫多肽序列分析利用TMHMM软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析Tg CDPK5(GenBank:EPT26997.1)的跨膜区域，分析结果显示该基因无跨膜区(图1)。因此在选取多肽制备抗体时不用避免跨膜区，可以选择氨基酸序列N端或C端免疫原性评分较高的区域选择多肽。利用IEDB网站(http://www.iedb.org/)中的Bepipred Linear Epitope Prediction软件(http://tools.immuneepitope.org/bcell/help/#Bepipred)预测B细胞表位。基线以上黄色区域评分较高的可以作为候选的多肽，见图2。

图1　Tg CDPK5的跨膜区分析

图2　B细胞表位分析

序号起点位置末端位置多肽序列长度(bp)1622AATKTSPVTAVVPGDSV1723238NGDATGA734459STPRTEKASATRCSTP16467111GRNTDVPEDGKDAAAVGEGNTKRGLDDFDADYGCRGGDCCDTSTK455123139N121EGKDKSQHDRREP176151159MNASEASRW97164200QCNSTCPGDGFDGASGTTAADGI181PASPQPEAPVF378215238QQITDIYDTPNGTSLGKGSYGSVV24

2.2免疫多肽的确定表1列举了Tg CDPK5序列N端的评分较高的多肽。按照结合多肽长度为15～20 bp较为合适的原则，选择表格中红色标注的多肽序列进行合成，获得Tg CDPK5免疫多肽。

2.3多克隆抗血清效价鉴定以纯化的Tg CDPK5合成多肽作为抗原包被ELISA反应板，已采集的多克隆抗体为一抗，同时以未免疫的兔血清为阴性对照，1∶10 000稀释的HRP标记羊抗兔IgG为二抗，效价以实验组的A450(P)/阴性血清对照组的A450(N)>2.1作为判定阳性的标准，检测结果显示多抗血清的效价为1∶640 000，见图3。对该多克隆抗体进行亲和纯化，纯化结果见图4。

图3　抗TgCDPK5蛋白多克隆抗血清效价分析

2.4多抗血清免疫活性鉴定Western blot实验结果表明，以免疫前正常兔血清作为对照，制备的抗Tg CDPK5抗体能特异性识别Tg的天然Tg CDPK5蛋白，在约75×103处可见一条特异性条带，而正常兔血清中未见(图5)。可见抗Tg CDPK5血清能特异性识别Tg CDPK5(75.4×103)条带。

2.5免疫荧光实验以免疫前正常兔血清作为阴性对照，进一步的免疫荧光实验结果表明，该多克隆抗体能特异性识别Tg内源Tg CDPK5蛋白。除此之外，通过DAPI核染发现，该蛋白以可溶的形式存在于虫体细胞质中。

M:Marker。

图4Tg CDPK5多抗纯化

1：抗血清；2：正常兔血清。

图5多克隆抗血清对天然的TgCDPK5蛋白的识别

绿色荧光：CDPK5；蓝色荧光：细胞核。

图6免疫荧光实验检测Tg CDPK5蛋白细胞定位

3讨论

CDPKs是一类庞大的蛋白激酶家族，属于丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶，广泛存在于各种植物及原生动物中。研究表明，Tg CDPK1能够有效的调控Ca2+依赖的胞外分泌，抑制Tg CDPK1的表达导致Tg运动性降低、入侵/离开宿主细胞能力减弱[9]；Tg CDPK3与恶性疟原虫CDPK1(PfCDPK1)高度同源(约50%)，对Tg离开宿主细胞的过程至关重要[10-11]。Zhang等[8]将真核表达质粒pVAX-TgCDPK5注射昆明鼠后产生强烈的细胞Th1免疫应答并一定程度上提高了感染Tg小鼠的生存时间，提示TgCDPK5可能与细胞毒力、侵袭力相关。本研究所涉及的Tg CDPK5基因(NCBI检索号：EPT26997.1)是Tg重要的功能基因，由682个氨基酸组成，其定位与生物学功能尚不清楚。关于Tg CDPK5对Tg生长、毒力、侵袭力、微线体分泌，以及水甘油渗透性的调控作用均未见报道。

为探究Tg CDPK5编码蛋白的功能，获得Tg CDPK5抗体显得意义重大。本实验通过生物信息学分析获得Tg CDPK5免疫多肽，成功制备了兔抗Tg CDPK5多克隆抗体。对于CDPKs在功能方面的研究通常采用生化方法来进行，可直接测定或使用特异性的激活剂来识别该酶的特异调节因子[12]。除此之外，较难通过直接提取和纯化的方式获得该蛋白。虽然体外表达目的蛋白可以获得具有天然活性的蛋白激酶，但该方法繁琐，需较大工作量。本研究通过对Tg CDPK5的序列信息分析，发现该基因无跨膜区，因此可以选择氨基酸序列N端或C端免疫原性评分较高的区域选择多肽。通过对Tg CDPK5蛋白的免疫原性分析，本研究选定该序列N端一段长17 bp的多肽序列进行合成，从而获得制备多抗所需的Tg CDPK5免疫多肽。该方法较之体外表达目的蛋白的方法更加简便直接，可以获得特异性较强的抗原，为后续抗体的成功制备奠定基础。

综上所述，本实验不仅制备了能特异性识别Tg内源性Tg CDPK5蛋白的兔抗Tg CDPK5多克隆抗体，还利用该多抗证实了Tg CDPK5蛋白以可溶形式存在于虫体细胞质中。在接下来的实验中，该抗体将会发挥更多使用价值。了解Tg CDPK5的作用机制，针对Tg CDPK5独特的生物学特性进行药物设计，对治疗Tg的药物研发具有指导性作用，也对顶复门其他原虫的药物研究有一定借鉴意义。

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Preparation of the polyclonal antibodies of CDPK5 gene from toxoplasma gondii and the identification of its functions*

Zhong Liangyin,Liu Simin,Zeng Zhihua,Xu Xiaosong,Lu Hanwei,Zhou Wenchao,Huang Yanting,Lu Jinghui,Chen Sicong

(DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofGuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou,Guangdong510080,China)

[Abstract]ObjectiveScreening the immune polypeptide sequence of toxoplasma (Tg) CDPK5 gene,which were synthesized and then immunized the New Zealand white rabbit to prepare antiserum,and identification its function.MethodsBioinformatics analysis was used to determine the immune peptide of Tg CDPK5 sequence,which were artificially synthesized to immune white rabbit to prepare antiserum.The titers of antibodies were determined by ELISA and the polyclonal antibodies were verified with CDKP5 antigen by Western blot.The sub-cellular localization of Tg CDPK5 were obtained by immunofluorescence assay.Results17 bp peptide sequence from the Tg CDPK5 N-terminal were chosen as immune polypeptide by bioinformatics analysis.Synthetic peptide were used to immune rabbit to obtain polyclonal antiserum.The result showed that the titer of the obtained ployantibody were 1∶640 000;Western blot demonstrated that the antiserum could specifically recognize Tg CDPK5(75.4×103);Immunofluorescence assay revealed this antibody could specifically recognize the endogenous Tg CDPK5 of Toxoplasma gondii.ConclusionAccording to the analysis of Tg CDPK5 sequence information,this study successful obtained Tg CDPK5 polyclonal antibody.

[Key words]toxoplasma gondii;CDPK5 gene;antiserum;immunofluorescence assy

doi:论著·基础研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.16.008

*基金项目：广东省医学科学技术研究基金项目(2015120124650789)。

作者简介：钟亮尹(1966-)，副主任技师，本科，主要从事临床免疫学研究。

[中图分类号]R392.7

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)16-2182-04

(收稿日期：2016-01-08修回日期：2016-03-28)