响应面优化甘草浸膏中甘草酸超声提取工艺

沈慧慧，艾力·艾山，王万强，何 薇，武耀存

(阿克苏出入境检验检疫局，新疆阿克苏 843000)



响应面优化甘草浸膏中甘草酸超声提取工艺

沈慧慧，艾力·艾山，王万强，何 薇，武耀存

(阿克苏出入境检验检疫局，新疆阿克苏 843000)

摘要[目的]利用响应面法优化超声提取甘草浸膏中甘草酸的工艺条件。[方法]在乙醇浓度、超声波时间及料液比等单因素试验的基础上，根据Box-Behnken 的中心组合设计原理采用3因素3水平的响应面分析法优化超声波提取甘草酸的工艺条件。[结果]超声提取甘草酸的最佳工艺条件为乙醇浓度70%、超声波时间30 min、料液比2.8 g/L，在此条件下甘草酸含量为8.34%。[结论]建立了甘草浸膏中甘草酸超声提取最佳工艺条件，为甘草浸膏的精深加工及进一步研究甘草酸在食品和医药领域产业化应用提供理论依据。

关键词响应面分析法；甘草酸；超声提取；甘草浸膏

甘草浸膏是由甘草加工制成的浸膏，具有和中缓急、润肺、解毒、调和诸药的作用，常与化痰止咳药配伍应用，能减轻对咽部黏膜的刺激，并有缓解胃肠平滑肌痉挛与去氧皮质酮样作用，用于治疗支气管炎、咽喉炎、支气管哮喘、慢性肾上腺皮质功能减退症[1]。评价甘草浸膏质量的重要指标是甘草酸的含量。甘草酸及其系列产品，对肉瘤、乳头瘤病毒、癌细胞生长有抑制作用，对艾滋病的抑制率高达90%，有较强的增加人体免疫功能作用，而且也是很好的食品添加剂和香料基料。

在食品工业中，常利用超声波的空化作用来促进物理和化学变化，提高效率，节约原料，改善产品质量等[2]。目前，响应面分析法[3-4]多用于优选甘草切片工艺[5]，甘草酸[6-7]、甘草多糖[8-9]、光甘草定[10-11]、总黄酮[12-13]的提取工艺优化，这些只针对甘草原料，而甘草浸膏方面的响应面优化尚属空白。笔者采用新疆产甘草浸膏为研究对象，以甘草酸含量为评价指标，在乙醇浓度、超声波时间、料液比等单因素试验的基础上，利用响应面分析法优化超声波提取甘草酸的工艺条件，以期为甘草浸膏的精深加工及进一步研究甘草酸在食品和医药领域产业化应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂甘草浸膏(新疆某甘草产业有限责任公司)；甘草酸铵对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110731-200614)。乙腈为进口迪马色谱纯，无水乙醇、磷酸均为分析纯，水为超纯水(美国Millipore公司ELIX3 QA10超纯水仪处理)。

1.2仪器与设备安捷伦RRLC 1200高效液相色谱仪(美国生产)，Elmasonic P 300H 超声波清洗仪(德国生产)。

1.3甘草酸含量的测定采用高效液相色谱法测定甘草酸含量。色谱条件：色谱柱为ODS-3(4.6 mm ×250.0 mm，5.0 μm)；流动相A为乙腈，流动相B为0.05%磷酸溶液；甘草酸检测波长为 237 nm；流速为1.0 mL/min；进样体积为10 μL；柱温为30 ℃。理论板数按甘草酸峰计算应不低于5 000[14]。1.4单因素试验影响甘草酸含量的主要因素有乙醇浓度、超声波时间、料液比。乙醇浓度采用40%、50%、60%、70%、80% 5个水平；超声波时间采用0、10、20、30、40、50 min 6个水平；料液比采用1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/L 5个水平，分别考察它们对甘草酸提取效果的影响。

1.5响应面优化试验在单因素试验的基础上，选取合适范围的因素参数，采用3因素3水平的响应面分析法进行优化试验，得到超声波提取甘草酸的最佳工艺参数。

1.6数据分析应用Design-Expert V8.0.6软件对试验数据进行分析。

2结果与分析

2.1标准曲线绘制取甘草酸铵对照品适量，精密称定，用70%乙醇制成1 mL含甘草酸铵0.2 mg(折合甘草酸为0.195 9 mg)的对照品溶液。用甘草酸铵对照品绘制标准曲线(图1)，回归方程：y=6.101 9x+4.092 9，R2=0.999 7，甘草酸铵对照品在10～160 ug/mL线性关系良好。

图1　甘草酸铵标准曲线Fig.1　Standard curve of ammonium glycyrrhetate

2.2单因素试验结果

2.2.1乙醇浓度对甘草浸膏中甘草酸含量的影响。固定超声波时间为30 min，料液比为2.0 g/L，研究不同乙醇浓度对甘草酸含量的影响，结果见图2。由图2可知，当乙醇浓度在40%～70%时，随着乙醇浓度的增加，甘草酸含量呈上升趋势，在乙醇浓度为70%时甘草酸含量达到最大，再升高乙醇浓度，甘草酸含量开始下降。可能是由于40%～70%的乙醇溶液对植物细胞组织的穿透性较强，对甘草酸的溶解性较好，而多糖、蛋白质等在醇溶液中易产生沉淀，提取液的杂质较少，因此，甘草酸提取效率较高。

图2　乙醇浓度对甘草浸膏中甘草酸含量的影响Fig.2　Effects of ethanol concentration on the content of glycyrrhizic acid from licorice extract

2.2.2超声波时间对甘草浸膏中甘草酸含量的影响。固定乙醇浓度为70%，料液比为2.0 g/L，研究不同超声波时间对甘草酸含量的影响，结果见图3。由图3可知，起始阶段，随着超声波时间的增加，甘草酸含量迅速上升，当超声时间为30 min时，甘草酸含量最高；当超声时间为30～40 min时，甘草酸含量下降，之后随着时间的延长，甘草酸含量变化不明显。甘草酸含量在起始阶段迅速上升的主要原因可能是超声波的空化作用产生极大的压力，造成细胞壁的破裂，并在瞬间完成，同时产生的振动作用强化了细胞内物质的释放、扩展和溶解，加速了样品中组分的溶出，提取效率较高[15]。当超声波时间达30 min时，这种空化效应造成的细胞破壁基本完成，甘草酸含量不再随时间的延长而显著增加，因此，当超声波超过一定时间后甘草酸提取效率不再明显上升。

2.2.3料液比对甘草浸膏中甘草酸含量的影响。固定乙醇浓度为70%，超声波时间为30 min，研究不同料液比对甘草酸含量的影响，结果见图4。由图4可知，甘草酸含量随料液比的增加而逐渐增加，这是因为料液比的增大会提高传质推动力，故甘草酸含量增加。但当料液比超过3.0 g/L时，甘草酸含量反而有所下降，这可能是由于料液比过大使甘草浸膏中的有机杂质提取增多，不利于甘草酸的溶出。

图3　超声波时间对甘草浸膏中甘草酸含量的影响Fig.3　Effects of ultrasonic time on the content of glycyrrhizic acid from licorice extract

图4　料液比对甘草浸膏中甘草酸含量的影响Fig.4　Effects of solid-liquid ratio on the content of glycyrrhizic acid from licorice extract

2.3响应面试验优化

2.3.1响应面分析因素水平的选取。根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，结合上述单因素试验结果，对乙醇浓度、超声波时间和料液比3因素3水平进行响应面试验设计，优化甘草浸膏中甘草酸的提取工艺，试验因素和水平见表1。

表1　试验因素和水平

2.3.2模型的建立。以甘草酸含量为响应值(Y)，乙醇浓度X1、超声波时间X2和料液比X3做如下变换[16]：xi=(Xi-X0)/X。式中，xi为自变量的编码值；Xi为自变量的真实值；X0为试验中心点处自变量的真实值；X为自变量的变化步长。共17个试验点，其中，12个为析因点，5个为零点，零点试验进行5次，以估计试验误差。甘草浸膏中甘草酸超声提取中心组合试验设计方案与试验结果见表2。

表2　中心组合试验设计方案与试验结果

对试验数据进行多项式拟合回归，以甘草酸含量(Y)为因变量，乙醇浓度(x1)、超声波时间(x2)和料液比(x3)为自变量，建立回归方程：Y=8.15+0.17x1+0.076x2+0.13x3-0.05x1x2+0.10x1x3-0.022x2x3-0.094x12-0.38x2-0.20x32

方差分析结果表明，p模型<0.000 1，达极显著水平，说明该方程能够正确反映甘草酸含量与乙醇浓度、超声波时间和料液比之间的关系。失拟项检验p=0.218 7>0.05，不显著，说明该回归方程与试验的拟合度较高。响应值的变异系数CV为0.82%，较低，说明试验操作可信。模型Radj2=0.952 4，能解释95.24%响应值的变化，因此，该模型与实际拟合较好，可以用该模型对超声波提取甘草浸膏中甘草酸工艺进行分析和预测。

从多项式拟合回归方程模型因变量的方差分析可知，模型一次项x1、x3差异极显著，x2差异显著；交互项x1x3差异显著，二次项x1差异显著，x2、x3差异极显著。由于各变量一次项的F值越大则说明其对甘草酸提取的影响越显著，可见各因素对甘草酸含量的影响程度由大到小依次为乙醇浓度、料液比、超声波时间。

2.3.3响应面分析及条件优化。通过Design-ExpertV8.0.6对回归结果做响应面和等高线，结果见图5～7。由图5～7可知，乙醇浓度和料液比的交互影响最为显著，乙醇浓度的影响比料液比更明显；超声波时间和料液比的交互作用最小，这与方差分析结果一致。

图5　乙醇浓度和超声波时间的交互作用Fig.5　Interaction between ethanol concentration and ultrasonic time

图6　乙醇浓度和料液比的交互作用Fig.6　Interaction between ethanol concentration and solid-liquid ratio

图7　超声波时间和料液比的交互作用Fig.7　Interaction between ultrasonic time and solid-liquid ratio

通过软件分析，回归模型预测的甘草酸超声提取的最佳工艺条件：乙醇浓度70%，超声波时间30.52min，料液比2.79g/L，在此条件下甘草酸的理论含量为8.29%。

2.3.4验证试验。采用回归模型所得的最佳工艺参数进行验证试验，研究预测结果与实际值的符合程度，从而判定模型是否稳定可靠。考虑到实际操作方便，将提取条件调整为乙醇浓度70%、超声波时间30min、料液比2.8g/L，重复3次试验以减少误差，所得甘草酸含量为8.34%，与理论预测值基本一致。可见基于响应面法所得的优化超声提取工艺参数可靠准确，重复性好，具有很强的实用价值。

3结论

该研究在单因素试验的基础上通过响应面法优化超声波提取甘草酸的工艺条件，建立了可良好预测甘草浸膏中甘草酸含量的模型，并获得最佳提取工艺条件：乙醇浓度70%，超声波时间30min，料液比2.8g/L，在此条件下甘草酸含量为8.34%，与预期值拟合度好。该工艺条件为甘草浸膏的精深加工及进一步研究甘草酸在食品和医药领域产业化应用提供科学依据。

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作者简介沈慧慧(1983- )，女，湖北仙桃人，工程师，硕士，从事进出口食品和农产品检验分析。

收稿日期2016-04-08

中图分类号S 567.7+1

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)13-167-04

Optimization of the Ultrasonic Extraction Technique of Glycyrrhizic Acid from Licorice Extract by Response Surface Method

SHEN Hui-hui, Aili·Aishan, WANG Wan-qiang et al

(Akesu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Akesu,Xinjiang 843000)

Abstract[Objective] To optimize the extraction technique for glycyrrhizic acid from licorice extract by response surface method (RSM).[Method] Based on the single factor tests on ethanol concentration,ultrasonic wave time and solid-liquid ratio,response surface method of three factors and three levels was adopted according to the Box-Behnken central composite design principle.The technological condition of glycyrrhizic acid was optimized by ultrasonic wave.[Result] The optimal extraction technology for glycyrrhizic acid was as follows:70%ethanol concentration,30 min ultrasonic time, 2.8 g/L solid-liquid ratio.Under this condition,the one-time extraction rate was 8.34%.[Conclusion] The optimal extraction technology for glycyrrhizic acid from licorice extract is established,which provides theoretical foundation for the intensive processing of extracts and the application of glycyrrhizic acid in food and medicine.

Key wordsResponse surface method(RSM); Glycyrrhizic acid; Ultrasonic extraction; Licorice extract