牡丹叶片气孔观察方法的比较研究

方纯娇，韩 雪，史冬燕，楚德昌

(菏泽学院生命科学系，山东菏泽 274015)



牡丹叶片气孔观察方法的比较研究

方纯娇，韩 雪，史冬燕*，楚德昌

(菏泽学院生命科学系，山东菏泽 274015)

摘要[目的]用5种不同方法制取牡丹叶下表皮制片并对其气孔进行比较研究。[方法]采用直接撕皮法、撕皮-刮去叶肉细胞法、NaOH离析法、过氧化氢-冰醋酸离析法和煮沸撕取法制取牡丹叶下表皮，对其制片指标进行了比较，并筛选出最佳染色剂。 [结果] 撕皮-刮去法和过氧化氢-冰醋酸离析法的制片效果较好，叶肉残留少、真实性强。0.5%的I-KI染液染色效果好。[结论]该研究结果可为今后不同品种牡丹叶表皮的微形态特征研究奠定基础。

关键词牡丹；气孔；观察方法；气孔密度

气孔是调节植物多种生理功能的重要器官，对植物的光合、呼吸、蒸腾等生理活动起着重要的调节作用[1]。植物叶片气孔的密度、大小、分布及运动规律对研究植物的适应性和抗逆性有重要作用[2]。许多学者对植物叶表皮气孔的显微特征研究发现叶表皮气孔形态在植物种质资源多样性、植物遗传变异、分类学及植物与其地理环境的关系方面有着重要意义[3-8]。

牡丹(Paeoniasuffruticosa)为芍药科芍药属植物的多年生落叶小灌木，素有“花中之王”的美誉。牡丹不仅有观赏价值，而且具有食用和药用价值。目前对牡丹的研究大多集中在叶片的解剖学结构[9]、光合性特征[10]、愈伤组织诱导[11]以及原生质体分离条件[12]等方面，但有关牡丹叶表皮获取方法研究则鲜见报道。笔者采用5种不同方法制取牡丹叶下表皮制片，并对其气孔进行比较研究，探索一种耗时短、操作简单、结果真实性强的牡丹叶下表皮制片方法，以期为今后不同品种牡丹叶表皮的微形态特征研究奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料牡丹叶片于2014年采自菏泽学院生物园。

1.2制片方法

1.2.1直接撕皮法。用镊子直接撕取叶片中部的下表皮(避开主要叶脉)，在载玻片上滴2滴蒸馏水，用毛笔将表皮展平，盖上盖玻片，压平后进行镜检。

1.2.2撕皮-刮去叶肉细胞法。将镊子撕取的叶下表皮置于带蒸馏水的载玻片上，用手术刀轻轻刮去残余叶肉细胞，再制片并观察。

1.2.3煮沸撕取法。采取同一牡丹上相对位置和大小相近的成熟叶片，洗净后选叶片中间部分连同叶脉剪成数段，每段约2 cm×2 cm。将处理好的牡丹叶片放入沸水中直至叶片变成深绿色，避开叶脉撕取叶下表皮，制片并观察。

1.2.4NaOH离析法。采取同一牡丹上相对位置和大小相近的成熟叶片，洗净后选叶片中间部分连同叶脉剪成数段，面积约为2 cm×2 cm。将处理好的叶片用5%NaOH浸泡处理7～8 h，用清水漂洗干净后，用镊子撕取叶脉外的叶下表皮制片观察。

1.2.5过氧化氢-冰醋酸离析法。采取同一牡丹上相对位置和大小相近的成熟叶片用H2O2-HAC(1∶1)离析液浸泡解离9～10 h，取出后用清水漂洗干净撕取叶下表皮，制片并观察。

1.3染色液的处理 将撕取的叶下表皮在载玻片上展平后分别用0.5%的I-KI染液、0.5%番红染液和1%番红染液染色3～5 min，压平后迅速进行镜检并拍照。

1.4气孔形态的比较观察 每个样品随机选20个视野，于40倍物镜下测量气孔器的长轴和短轴。每个样品随机取30个视野，计算每个视野内的气孔数，除以视野面积，计算气孔密度(个/mm2)。利用数码显微镜摄像系统(Olympus BX53)，图像处理系统使用Cellsens Standard软件测量，用Excel 2003进行数据统计与分析。

2结果与分析

2.15种获取方法的制片指标比较从表1和图1可以看出，直接撕皮法和撕皮-刮去法制片时间短，需要1～2 min；其次是煮沸撕取法；但是， NaOH离析法、H2O2-HAC离析法需要8～10 h。撕皮-刮去法和H2O2-HAC离析法残留叶肉细胞最少，清晰度最高；其次是直接撕皮法。从取样能力和定位性来看，煮沸撕取法、NaOH离析法和H2O2-HAC离析法较好，基本可以在全叶面任一部位取样；直接撕皮法和撕皮-刮去法取样能力和定位性差，取样面积也相对较小。

表1　不同下表皮获取方法的制片结果比较

注：“-”表示无残物；“+”表示有少量残物；“++”表示有较多残物；“+++”表示有大量残物。

Note：“-”:no residue; “+”:few residue; “++”:more residue; “+++”:a lot of residue.

注：A.直接撕皮法；B.撕皮刮去法；C.煮沸撕取法；D.NaOH离析法；E.H2O2-HAC离析法。Note：A. Direct tearing method; B. Tearing-scraping method; C. Boiling tearing method; D. NaOH isolation method; E. H2O2-HAC isolation method.图1　不同方法获得的牡丹叶下表皮压片的观察(400×)Fig.1　Observation of Paeonia suffruticosaeaf lower epidermis with different methods(400×)

2.2不同染色剂对制片效果的影响从图2可以看出，0.5%I-KI染液染色效果最好，可以清楚看到表皮细胞的形态、气孔器的结构和保卫细胞内部分内含物质，细胞界线清晰，制片清晰程度高。0.5%番红染液处理气孔器的结构和表皮细胞也能看出，但染色的均匀度不好。1%番红染液的染色效果不理想，只能反映出气孔器的大概轮廓及开闭状态，表皮细胞形态模糊。

注：A.0.5%I-KI染液；B.0.5%番红染液；C.1%番红染液。Note：A. 0.5%I-KI staining; B. 0.5% A red dye;C. 1% A red dye.图2　不同染色剂获得的牡丹叶下表皮压片观察(400×)Fig.2　Observation of Paeonia suffruticosaeaf lower epidermis with different staining methods

2.3撕皮-刮去法和H2O2-HAC离析法的气孔真实度比较从表2可以看出，撕皮-刮去法和H2O2-HAC离析法对2种牡丹进行试验，所测得的气孔器长轴、短轴及气孔密度无显著差异。从气孔器长轴和短轴长度来看，H2O2-HAC离析法测定值比撕皮-刮去法的测定值偏大。通过气孔器大小和气孔密度的测定结果可以看出，2种方法获得的叶表皮制片的真实性都较高。

表2　撕皮-刮去法和冰醋酸离析法的气孔形态比较

3结论

通过对5种不同方法的比较，直接撕皮法和撕皮-刮去叶肉细胞法制取下表皮是随机的，其取样能力和定位性能较差，但制片清晰度较高，操作简单、真实性强等优点，使用于叶脉少，叶肉与表皮易于分离的牡丹品种。煮沸撕取法、NaOH离析法和H2O2-HAC离析法3种方法而言，定位性能强，所需仪器设备少，但煮沸撕取法和NaOH离析法叶肉细胞残留较多，影响试验结果的观察。H2O2-HAC离析法耗时较长，但不受材料的限制，且叶肉残留少、真实性强，可以大批量处理试验材料，此方法不仅可用于气孔形态、开关状态和分布状况等定性指标测定，还可以进行气孔形态学指标的定量研究。不同染色剂对制片的影响结果来看，0.5%I-KI染色效果最好，气孔器和表皮细胞的形态清晰、界线明显。因此，选择有效、适应性广的牡丹叶下表皮气孔观察方法，为进一步研究不同牡丹品种气孔形态学和抗逆生理的研究具有重要的辅助作用。

参考文献

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[10] 吕淑芳，孔祥生，王征宏，等.不同牡丹品种叶片光合特性研究[J].河南农业科学，2009(2)：87-89.

[11] 齐向英，陈宗礼，薛浩，等.矮牡丹叶片愈伤组织诱导研究[J].江苏农业科学，2012，40(1)：48-49.

[12] 于相丽，李勇慧，李业，等.牡丹叶片原生质体分离条件的研究[J].河南农业科学，2012，41(1)：122-125.

基金项目菏泽学院开放实验室(植物生物学实验室)项目；菏泽学院科研研究项目(XYJJKY-2，XY13KJ02)。

作者简介方纯娇(1994- )，女，福建漳州人，本科生，专业：生物科学。*通讯作者，副教授，硕士，从事植物逆境生理研究。

收稿日期2016-03-29

中图分类号S 601

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)13-041-02

Comparative Study on the Observation Method ofPaeoniasuffruticosaLeaf Stomata

FANG Chun-jiao, HAN Xue, SHI Dong-yan*et al

(Department of Life Sciences, Heze University, Heze, Shandong 274015)

Abstract[Objective] Five different methods of Paeonia suffruticosa leaf lower epidermis slice-preparing and the observation of stomata were comparatively studied. [Method] The slice of Paeonia suffruticosa leaf lower epidermises were prepared with the method of directly tearing leaf epidermis, tearing leaf epidermis-scrape off mesophyll cells, NaOH maceration, H2O2-HAC maceration and boiling-tearing leaf epidermis and the preparation index was compared and the best stain was screened. [Results] The treatment of tearing leaf epidermis-scrape off mesophyll cells and H2O2-HAC maceration was best in all of preparation methods, which was less residual mesophyll and highly facticity. In the dyeing treatment, the treatment of 0.5% I-KI showed the good efficiency. [Conclusion] The foundation for the future research on the micro-morphological characteristics of Paeonia suffruticosa leaf lower epidermis of different varieties would be laid.

Key wordsPaeonia suffruticosa; Stoma; Observation method; Stomatal density