晚期非小细胞肺癌乳头瘤病毒感染状况及其与P16表达的关联性研究

闫　滢，李　明，胡　冰，何义富

(安徽省立医院西区　安徽省肿瘤医院,a.肿瘤内一科,b.检验科，安徽 合肥　230031)



◇临床医学◇

晚期非小细胞肺癌乳头瘤病毒感染状况及其与P16表达的关联性研究

闫滢a，李明b，胡冰a，何义富a

(安徽省立医院西区安徽省肿瘤医院,a.肿瘤内一科,b.检验科，安徽 合肥230031)

摘要：目的探讨晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)人乳头瘤病毒 (human papillomavirus，HPV)感染状况及其与P16的相关性研究。方法收集83例临床确诊的晚期NSCLC患者石蜡包埋组织标本，采用Luminex液相芯片技术对所有标本进行HPV基因分型，免疫组化法检测P16表达情况。收集患者临床病理资料，分析HPV感染和P16表达对患者无进展生存期(progression-free survival，PFS)的影响。结果83例晚期NSCLC患者组织中HPV感染率为24%(20/83)，HPV感染主要发生在非吸烟者、淋巴结不转移者和分化程度较差者(P=0.048，P=0.044，P=0.024)。40%的HPV感染肿瘤组织P16表达阳性。多因素分析发现分化程度差(odds ratio=0.163) 是HPV感染的独立预测因子。P16阳性患者较P16阴性患者具有更长的PFS(P<0.023)。结论研究结果表明P16蛋白表达与HPV感染无相关性，但P16蛋白表达可能是晚期NSCLC具有较长生存期的独立预测因子。

关键词：癌,非小细胞肺；乳头状瘤病毒科；周期素依赖激酶抑制剂P16

肺癌已成为全世界范围内致死率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占85%左右。NSCLC的发生与环境因素和遗传因素密切相关[1]，其中吸烟、环境污染、放射性污染是NSCLC发生的主要因素。然而，并不是所有肺癌的发生都与上述因素相关，HPV感染被认为是肺癌发生的潜在影响因素之一[2]。许多研究报道，在肺癌组织中存在着较高的HPV感染检出率，但目前由于存在检测方法的差异、地域差异和标本类型的差异，肺癌组织中HPV检出率差异较大，且HPV感染引起肺癌发生发展的机制尚未得到阐明，致使HPV感染与肺癌的相关性存在一定争议[3-4]。

P16是一种细胞周期依赖性蛋白酶抑制剂，能抑制肿瘤细胞抑制因子视网膜细胞瘤蛋白的磷酸化，导致其被激活及抑制后续的细胞周期进展[5]。尽管有研究表明在宫颈癌和头颈癌中HPV感染与P16表达显著相关，但在肺癌组织中HPV感染和P16是否存在相关性依然存在争议[6]。本研究对83例晚期NSCLC患者HPV感染和P16的表达情况做一回顾性分析。

1资料与方法

1.1临床资料选取83例在2011年8月至2013年8月间到安徽省立医院(含南区、西区)化疗的Ⅲ～Ⅳ期的非小细胞肺癌患者，所有病例均经临床和病理确诊，且病理标本在我院，其中男53例、女30例，年龄40～84岁(中位数64岁)，鳞癌21例、腺癌62例。标本类型包括：17例外科手术标本、12例肺活检标本、15例支气管镜活检标本、24例胸腹水标本、13例淋巴结活检标本和2例骨活检标本。所有病例均经患者知情同意，并经安徽省立医院医学伦理委员会批准。从石蜡包埋的肿瘤组织标本中切取 6～7 片 8 μm厚的切片，放入1.5 mL离心管中备用，同时切取3片6 μm厚的切片固定于载玻片上，以被免疫组化使用。所有石蜡包埋标本切片前均有一位高年资病理科老师现场复镜，确认所切标本为典型肺癌组织标本，所有石蜡标本切片均为一名高年资病理技术老师亲自切片。临床病理特征包括：年龄、性别、吸烟史、组织类型、组织分化程度、淋巴结转移和远处转移。

1.2组织DNA抽提将放置组织切片的离心管中，加入1 mL的二甲苯，室温振荡混匀。离心后弃上清，再加入1 mL的无水乙醇去除二甲苯，离心后按照试剂盒(Qiagen)的操作说明进行样本DNA的提取，经脱蜡、离心、脱苯、涡旋震荡，孵育过夜等步骤进行样本DNA的提取，最终将样品DNA溶解于80 μL洗脱缓冲液中，分光光度计检测DNA浓度，A260/A280检测DNA纯度，-80 ℃保存备用。

1.3HPV-DNA分型检测采用上海透景生命科技公司Luminex液相芯片技术检测组织中HPV基因型的过程中，PCR扩增所用引物为涵盖了26种不同HPV亚型的通用型引物，该引物针对组织HPV L1片段的高保守区[7]。同时，为了对样本采集量、标本处理、PCR扩增和仪器状态进行监测，加入了内参对照β-globin PCR引物，用于扩增β-珠蛋白基因；应用多重PCR流式杂交技术检测样本组织中提取的DNA是否存在HPV的感染，包括19种高危型(HPV-16，18，26，31，33，35，39，45，51，52，53，55，56，58，59，66，68，82及83)及7种低危型(HPV-6，11，40，42，44，61及73)。取5 μL提取的DNA样本进行PCR扩增反应，95 ℃ 30 s，58℃ 30 s，72 ℃ 30 s (5个循环)；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s (35个循环)，72 ℃ 5 min。以此PCR产物进行快速的杂交反应，95 ℃ 5 min；48 ℃ 30 min；Luminex 200多功能流式点阵仪系统进行杂交结果的检测，然后应用Tellgen公司相应的试剂盒数据分析软件进行数据分析。

1.4免疫组织化学法检测P16蛋白表达水平载玻片上的石蜡包埋组织标本经一系列浓度的二甲苯，乙醇的混合液侵泡脱蜡，然后用微波炉中蒸煮的方法，采用pH=6.0的10 mmol·L-1的柠檬酸缓冲液进行抗原修复。然后用10倍稀释的正常兔血清进行抗原封闭，加入鼠抗人P16单克隆抗体，4 ℃冰箱中保存过夜，然后加入生物素标记的鼠抗二抗1 h后，加入DAB显色。样本先在低倍镜下进行评估，然后调到高倍镜下根据细胞染色情况进行P16的分类。

1.5统计学方法采用SPSS16.0软件进行统计分析。HPV感染状态与临床病理特征(包括年龄、性别、吸烟史、组织类型、分化程度、淋巴结转移、远处转移和P16蛋白表达)的关联关系采用χ2检验，多因素分析采用Logistic回归。 PFS定义为从患者初次诊断时间到复发或转移的时间(或至最后失访的时间)。此外，HPV感染、P16蛋白表达等与患者PFS之间的关系，采用Kaplan-Meier生存分析和COX回归方法，P<0.05被认为差异有统计学意义。

2结果

2.1NSCLC患者组织中P16蛋白表达水平根据组织样本化学染色阳性颗粒的密度对NSCLC患者组织中P16蛋白表达水平进行定性分析。组织样本细胞核化学染色分为四个等级：阴性(不能检测到细胞核染色)、+(可检测到的细胞核染色)、++(易检测的可见细胞核染色)、+++(细胞核染色强阳性)。P16蛋白表达的阳性和阴性免疫组织化学染色情况见图1。

P16阴性图P16阳性图

图1非小细胞肺癌中P16表达水平(免疫组化×400)

2.2NSCLC患者HPV感染与临床病理特征之间的相关性采用Luminex液态芯片技术对83例晚期非小细胞肺癌患者进行HPV-DNA检测，HPV阳性率为24%，其中HPV阳性20例，HPV阴性63例。HPV感染亚型包括HPV16，18，33，58，6 和 11，其中HPV16亚型最为常见。HPV感染主要发生在非吸烟者、淋巴结转移者和分化程度较差者(P=0.048,P=0.044,P=0.024)。33.7%(28/83)的晚期NSCLC患者肿瘤组织P16表达阳性。然而，未见HPV感染与TP16蛋白表达具有相关性(见表1)。采用多因素Logistic回归模型分析发现分化程度差(OR=0.163) 是HPV感染的独立预测因子(见表2)。

表1　NSCLC患者HPV感染与临床病理

表2　HPV感染影响因素的多因素分析

2.3HPV感染和P16蛋白表达对患者PFS的影响分析为了进一步评估HPV感染、P16蛋白表达对晚期非小细胞患者的相关性，本试验采用患者PFS作为评价指标。采用Kaplan-Meier生存曲线分析方法绘制HPV感染状态(阳性和阴性)、P16蛋白表达(阳性和阴性)生存曲线图(见图2)。发现HPV阳性患者中位无进展生存期为12个月，HPV阴性患者中位无进展生存期为8个月，但差别无统计学意义(HR 0.68,95% CI 0.409～1.161,P=0.162)。P16蛋白表达对晚期NSCLC患者PFS有显著影响(HR 0.562,95% CI 0.341～0.924,P=0.023)(见表3)，其中P16蛋白表达阳性患者(M=28，其中2个死亡)中位无进展生存期为11个月，TP16阴性患者(M=55，其中3个死亡)中位无进展生存期为8个月。

注：(A)HPV阳性和阴性患者PFS生存曲线图，HPV阳性患者(n=20，其中1例死亡)中位无进展生存期为12个月，HPV阴性患者(n=63，其中4例死亡)中位无进展生存期为8个月。

(B)P16阳性和阴性患者PFS生存曲线图，P16阳性患者(n=28，其中2例死亡)中位无进展生存期为11个月，TP16阴性患者(n=55，其中3例死亡)中位无进展生存期为8个月。

图2Kaplan-Meier生存曲线

3讨论

本实验的研究结果表明，83例我国晚期非小细胞肺癌患者HPV-DNA的检出率为24%，感染类型以HPV16亚型为主，数据同时显示HPV感染与吸烟、淋巴结转移和组织分化程度显著相关。同时，我们发现P16蛋白表达阳性患者较阴性患者有更长的无进展生存期。

表3　Cox回归分析结果

尽管吸烟已被公认为是引起肺癌的最重要的危险因素，但仍有大约15%的男性肺癌患者和53%的女性肺癌患者一生中从未烟草接触史[8]，也就是说不吸烟者仍有一部分会患肺癌，HPV感染被认为可能是肺癌发生的潜在影响因素之一。最近的一项研究表明亚洲人群NSCLC患者HPV感染率为28.1%，欧洲人群NSCLC患者HPV感染率为8.4%，美洲人群NSCLC患者HPV感染率为21.3%，亚洲人群NSCLC患者HPV感染率高于欧美人群[9]。在100多种亚型的HPV病毒中，在NSCLC患者中虽然也检测出HPV6、11、31、39、52、58、82亚型，但HPV16和18亚型最为常见。本研究中我们检测出了HPV16、18、33、58、6 和 11，其中HPV16亚型最为常见，与以前报道结果一致。本实验HPV-DNA阳性检出率为24%，低于亚洲人群的28.1%，我们推测可能是因为本次试验选取的样本均为晚期Ⅲ～Ⅳ NSCLC患者石蜡包埋标本，HPV感染可能与肺癌的临床分期和标本类型有关。最近研究表明HPV感染的NSCLC患者常见于女性、非吸烟、组织分化程度较差和淋巴结不转移患者。本研究中我们同样发现HPV感染与组织分化程度较差、非吸烟者和淋巴结不转移的NSCLC患者，因此，本试验结果与前期报道结果一致。

本研究发现晚期NSCLC患者P16蛋白表达与HPV感染无相关性。最近Gatta等[10]采用免疫组化对83例NSCLC组织样本进行P16蛋白表达分析，也证明TP16蛋白表达与HPV感染无相关性。然而，我们通过生存曲线分析发现P16蛋白表达阳性患者较阴性患者有更长的无进展生存期，P16可能作为晚期NSCLC患者预后的独立预测因子。当然研究结果可能受到地域差异影响[11]，下一步我们将进一步研究P16蛋白在NSCLC疾病发生发展中可能存在的作用。

总之，本研究我们证实了在晚期NSCLC患者P16蛋白表达与HPV感染无相关性，P16蛋白表达可能作为晚期NSCLC患者预后的预测因子。

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The association between P16 expression and human papillomavirus in advanced non-small cell lung cancer

YAN Yinga,LI Mingb,HU Binga,et al

(a.DepartmentofMedicalOncology；b.DepartmentofClinicalLaboratory，AnhuiProvincialCancerHospital，Hefei,Anhui230031，China)

Abstract:ObjectiveThe present study examined the association between HPV infection and P16 expression in Chinese patients with advanced NSCLC.MethodsA total of 83 advanced NSCLC patients were enrolled in the study.The status and genotype of HPV infection were determined by luminex liquid chip and the presence of P16 expression in tumor tissue was determined by immunohistochemistry.Clinical characteristics of these patients were also recorded to investigate the impact of HPV infection and P16 expression on progression-free survival.ResultsHPV DNA was detected in 20 out of 83 (24%) lung tumors and was observed more frequently in non-smokers,patients with no lymph node metastasis,and patients with poorly differentiated tumors (P=0.048,P=0.044 andP=0.024,respectively).Eight (40%) were positive for P16 expression.Multivariate analysis revealed that poor differentiation alone (odds ratio=0.163) was an independent predictive factor of HPV infection in advanced NSCLC.P16-positive patients had a significantly longer survival time when compared with P16-negative patients(P<0.023,log-rank test).ConclusionsOur results suggest that P16 protein expression is not associated with the expression of HPV DNA,but that P16 expression may be an independent prognostic factor of long survival in advanced NSCLC.

Key words:Carcinoma,non-small-cell lung;Papillomaviridae;Cyclin-dependent kinase inhibitor p16

基金项目:安徽省自然科学基金(1408085MH179)

通信作者:何义富，男，副教授，硕士生导师，研究方向：肿瘤化疗相关机制研究，E-mail:18919685630@163.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.06.018

(收稿日期：2016-01-27,修回日期：2016-03-23)