银杏总黄酮通过调节自噬减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的研究

沈秀珍,王　凌,方毅华

(赤壁市人民医院心内科，湖北 赤壁　437300)



银杏总黄酮通过调节自噬减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的研究

沈秀珍,王凌,方毅华

(赤壁市人民医院心内科，湖北 赤壁437300)

摘要：目的探讨银杏总黄酮是否可以通过调节自噬减轻心肌缺血再灌注(I/R)损伤以及可能的机制。方法采用大鼠心肌I/R模型(缺血30 min，再灌注4 h)，雄性SD大鼠30只随机分为三组：假手术组(SO组，n=10)、缺血再灌注组(I/R组，n=10)和银杏总黄酮治疗组(YLTF+I/R组，n=10，100 mg·kg-1，造模前灌胃7 d)。检测心肌损伤标记物肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌钙蛋白I(cTnI)；检测氧化应激水平，即丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平；检测自噬蛋白beclin-1和LC3水平。结果与SO组比较，I/R可诱导心肌损伤标记物(CK、LDH和cTnI)表达升高，氧化应激水平的增加(MDA表达增加，SOD表达降低)和自噬的过度激活(LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增加，beclin-1表达增加)；与I/R比较，银杏总黄酮可显著的降低心肌损伤标记物(CK、LDH和cTnI)的表达、氧化应激水平(MDA表达降低，SOD表达增加)和自噬的过度激活(LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低，beclin-1表达减低)。结论银杏总黄酮可以通过抑制过度自噬减轻心肌I/R损伤，这可能与其抑制氧化应激作用有关。

关键词：再灌注损伤；银杏素；自噬；大鼠,Sprague-dawley

自噬是细胞在应激或不良状态下的一种自我保护过程，可以清除降解的蛋白质和损伤的细胞器[1]。通常认为，自噬是细胞稳态的维护者，然而，过度的自噬也可以引起细胞死亡，称为自噬性程序性细胞死亡(程序性死亡共三种，另外两种为凋亡和坏死)，这说明自噬对细胞的影响是多样的、复杂的[2]。前期的研究证实，自噬是心肌缺血再灌注损伤的重要机制之一，它在损伤的起始和进展过程中都发挥了重要作用[3-4]。

银杏叶提取物(ginkgo biloba extract,EGb)具有良好的药用价值，且已有多种产品用于临床，如银杏叶片，银杏达莫等。研究发现，EGb具有抗炎、抗氧化、扩血管、改善循环和降血脂等多种作用[5-6]。银杏总黄酮是银杏叶提取物中含量最高的活性成分，具有良好的抗氧化和清除自由基的作用[7-8]。我们知道，氧化应激是导致自噬过度激活的重要因素[9-10]，但银杏总黄酮是否可以通过调节自噬减轻心肌I/R损伤，目前尚无研究，为验证上述假设我们在2015年10～12月进行了下述研究。

1资料与方法

1.1动物准备与分组30只SPF级成年雄性SD大鼠(200～250 g，动物合格证号：43004700019087)，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。于恒温、恒湿、明/暗交替(12 h)的环境喂养48 h。

大鼠缺血再灌注模型：2%戊巴比妥钠麻醉(40 mg·kg-1，ip)后，仰卧固定于鼠板，气管插管(频率：70 bpm，吸呼比=1∶1.5，潮气量：3～4 mL/100 g，小动物呼吸机：江西特力麻醉呼吸设备有限公司)。胸骨左缘切口，暴露心脏，破心包膜；于左心耳下2～3 mm处将前降支与一个中间带有凹槽的空心乳胶管一起结扎。结扎线下心肌变苍白表明缺血成功。缺血30 min后，沿乳胶管凹槽剪断结扎线再灌注4 h。再灌注4 h后，2%戊巴比妥钠麻醉(20 mg·kg-1,ip)，颈静脉采血2 mL，迅速剪下心脏，剪除多余部分留取心梗区(白色)和缺血区(白色附近5 mm)用于检测。30只大鼠随机分为3组：(1)手术组(SO，n=10)：仅插管、开胸、LAD下穿线但不结扎；(2)缺血再灌注组(I/R，n=10)：按照上面所述造模，缺血30 min，再灌注4 h；(3)青蒿素治疗组(YLTF+I/R，n=10)：造模前银杏叶总黄酮灌胃7 d(100 mg·kg-1，西安源森生物科技有限公司)，造模同I/R组。

1.2检测指标和方法

1.2.1分光光度法检测血清乳酸脱氢酶(LDH)，肌酸激酶(CK)和肌钙蛋白I(cTnI)通过心肌损伤标记物(LDH、CK、cTnI)的表达水平反映心肌损伤情况。静脉采血后静置10 min，待血液凝固后离心(3 000 r·min-1×15 min)，取血清。选用南京建成生物工程研究所试剂盒，严格按照说明操作检测LDH和CK。

1.2.2检测丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平通过检测MDA和SOD评价心肌组织氧自由基含量和脂质超氧化水平。检测方法如前所述[11]，采用南京建成生物工程研究所的MDA和SOD试剂盒，严格按照说明操作。

1.2.3Western blot法检测LC3和beclin-1方法如前所述[12]，简言之，组织匀浆在PAGE胶中电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭，1抗孵育过夜，包括LC3(1∶500稀释，sigma)，beclin-1(1∶500稀释，Abcanm)和β-actin(武汉博士德生物工程有限公司)。在相应的二抗孵育后，ECL显色，以其与β-actin的比值表示其相对表达量。

2结果

2.1血清LDH，CK和cTnI结果见表1。与SO组比较，I/R组中LDH，CK和cTnI水平明显升高(P<0.05)；YLTF+I/R组中CK和cTnI水平明显增高(P<0.05)，LDH有增高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。与I/R组比较，YLTF+I/R组中LDH、CK和cTnI水平明显降低(P<0.05)。

表1　青蒿素对心肌损伤标记物的影响

注：与SO组比较，aP<0.05；与I/R组比较，bP<0.05。

2.2心肌组织MDA和SOD水平结果见表2。与SO组比较，I/R组中MDA表达明显升高，而SOD表达明显降低。与I/R组比较，YLTF+I/R组中MDA表达明显下降，而SOD表达明显升高(均P<0.05)。

2.3心肌组织LC3与beclin-1水平结果见表2。与SO组比较，I/R组中LC3-Ⅱ/Ⅰ和beclin-1水平明显升高(均P<0.05)。与I/R组比较，YLTF+I/R组中LC3-Ⅱ/Ⅰ和beclin-1水平明显降低(均P<0.05)。

3讨论

银杏叶是我国临床上经常使用的中药材之一，EGb种类繁多，其中最重要的活性成分为总黄酮和萜内酯(包括白果内酯和银杏内酯)。在EGb中总黄酮含量达到24%，萜内酯仅占0.6%，可见总黄酮为EGb的主要活性成分。研究证实，银杏叶总黄酮有显著的扩血管、抗氧化的作用[7-8]。进一步证实，EGb的抗氧化作用与抑制NF-kapaB通路激活相关。本研究发现，银杏叶总黄酮可明显抑制氧自由基生成(降低MDA水平)，增加脂质超氧化(增加SOD水平)，这进一步印证了银杏总黄酮具有明显抗氧化作用[13]。但本研究首次发现，银杏总黄酮可以明显降低LC3-Ⅱ/Ⅰ比值和beclin-1表达，及抑制过度自噬减轻心肌缺血再灌注损伤。

表2　青蒿素对氧化应激和自噬的影响

注：与SO组比较，aP<0.05；与I/R组比较，bP<0.05。

研究表明，自噬是心肌I/R的重要病理生理机制之一[3-4]。I/R诱导的ATP耗竭、氧化应激、内质网应激和蛋白质降解等均会增强自噬[9-10]。自噬对细胞的影响是多面性的，适度的自噬可以帮助细胞清除降解的蛋白质和损伤的细胞器，具有保护作用，但过度激活自噬却可以导致细胞程序性死亡。目前自噬对心肌I/R的作用尚无定论，通常认为，在心肌缺血阶段，自噬被适度激活，表现为心肌保护作用，但在再灌注阶段，自噬被过度激活，表现为加重心肌损伤的作用[3-4]。Matsui等[10]证实，在心肌再灌注阶段beclin-1水平明显升高bcl-2明显降低，标志自噬被过度激活，进而诱发细胞程序性死亡。beclin-1是一种关键的自噬蛋白，可以调节自噬小体的形成和进展。在再灌注阶段，beclin-1是诱导自噬过度激活的关键蛋白，研究证实，通过siRNA抑制beclin-1表达可以抑制自噬的过度激活，减轻I/R损伤[14-15]。众所周知，在再灌注阶段，氧自由基的过度生成而非能量耗竭是诱导细胞自噬的主要因素。Hariharan等[16]证实，氧自由基的生成伴随beclin-1的高表达，给予抗氧化剂处理可明显降低beclin-1的表达，这说明，活性氧是通过调节beclin-1的表达调节再灌注阶段的心肌细胞自噬。另外，LC3为自噬相关蛋白，LC3-Ⅱ为脂质化的活性状态，LC3-Ⅰ为未脂质化的非激活状态，LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值可以反应自噬的激活状态。研究发现，活性氧可通过抑制ATG4的激活，促进LC3脂质化激活自噬[17]。本研究发现，银杏总黄酮可以明显抑制氧化应激(降低MDA水平，升高SOD水平)，抑制过度自噬(降低beclin-1水平和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值)，因此我们推测，银杏总黄酮可以通过抑制氧化应激，抑制心肌I/R中自噬过度激活。

综上所述，银杏总黄酮可以通过抑制氧化应激抑制I/R过程中过度自噬进而减轻心肌I/R损伤。

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Yinxing leaf total flavonoid mitigates myocardial ischemia and reperfusi on injury via regulating autophagy

SHEN Xiu-zhen,WANG Ling,FANG Yi-hua

(DepartmentofCardiology,RenminHospitalofChibi,Chibi,Hubei437300,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate whether Yinxing leaf total flavonoid could mitigate myocardial ischemia and reperfusion(I/R) injury and the possible mechanism.MethodsRats I/R model (ischemia 30 min,then reperfusion 4 h) was used.30 rats were divided into three groups:sham-operation group (SO,n=10),ischemia and reperfusion group (I/R,n=10) and Yinxing leaf total flavonoid treatment group (YLTF+I/R,n=10,100 mg·kg-1).Cardiac injury markers (serum creatine(CK),lactate dehydrogenase(LDH),and cTnI),oxidative stress (malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD)) and autophagy markers (beclin-1 and LC3) were detected.ResultsCompared with SO group,levels of cardiac injury markers (CK,LDH and cTnI) and oxidative stress (MDA and SOD) significantly increased; autophagy was excessively activated in I/R group.Compared with I/R group,Yinxing leaf total flavonoid significantly decreased cardiac injury markers'(CK,LDH and cTnI) expression and oxidative stress (MDA expression increased and SOD expression decreased),and suppressed excessive activation of autophagy both beclin-1 level and LC3-Ⅱ/Ⅰ ratio decreased).ConclusionsYinxing leaf total flavonoid could mitigate I/R injury via inhibiting excessive activation of autophagy.It's possible that Yinxing leaf total flavonoid inhibited excessive autophagy via suppressing oxidative stress.

Key words:Reperfusion Injury;Ginkgetin;Autophagy;Rats,Sprague-dawley

作者简介：沈秀珍，女，副主任医师，研究方向:心肌梗死和冠心病方向研究，E-mail：414542231@qq.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.06.010

(收稿日期：2016-02-23，修回日期：2016-03-20)