O-羧甲基壳聚糖制备工艺研究

李秋萍

(中国药科大学综合门诊部,江苏 南京　211198)



O-羧甲基壳聚糖制备工艺研究

李秋萍

(中国药科大学综合门诊部,江苏 南京211198)

摘要：目的以壳聚糖为原料，运用苯甲醛与氨基的席夫碱反应保护壳聚糖C2位氨基的方法制备O-羧甲基壳聚糖(O-CMC)，并得到最佳反应条件。方法 以产品的收率、取代度为指标，通过单因素实验研究碱浓度，氯乙酸与苯甲醛化的壳聚糖的质量比，温度对羧甲基反应的影响。结果最佳反应条件为25%的NaOH溶液，氯乙酸/苯甲醛化的壳聚糖的质量比为2.8，反应温度为70 ℃。结论壳聚糖在最佳反应条件下可制备得到取代度和收率较高的O-羧甲基壳聚糖。

关键词：壳聚糖；药物调剂

羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl chitosan，CMC)，是一种水溶性的两性聚电解质，由壳聚糖(Chitosan，CTS)经化学改性引入羧甲基后得到。由于壳聚糖分子结构中有2个羟基(C3位和C6位)和1个氨基(C2位)，羧甲基化在这3个位置均可以发生。因此产物有N,O-CMC、N-CMC和O-CMC[1]。O-CMC与N,O-CMC、N-CMC相比，既含有氨基又含有羧基，具有更好的促凝血性、生物降解、抑菌作用[2]；可加快损伤愈合，有效地防止组织黏连和瘢痕的形成[3]；对酸根离子、蛋白质具有较好的吸附效果[4]，对重金属离子的负载能力强[5]；并具有良好的成膜性、吸湿性和保湿性[6]，广泛地应用于食品、医药、化妆品、化工等领域。有关O-CMC的制备，国内报道较多的是采在较低温度下在碱性介质中与氯乙酸进行反应将羧甲基引入在CTS O-位，但在上述反应条件下仍会有少量N-位CMC产物，特别是为了获得具有较高取代度的产物而反应时间较长时N-位产物的出现会较明显，而且反应过程中易受温度波动的影响[7]。本文以CTS为原料，利用苯甲醛与氨基的席夫碱反应生成亚胺结构来保护其链上的氨基，再在碱性条件下接入羧甲基后在酸性条件下除去苯甲醛，生成O-CMC。

1材料与仪器

1.1材料与试剂大连雪蟹壳、甲壳素：江苏双林海洋生物药业有限公司；氯乙酸：国药集团化学试剂有限公司；苯甲醛：永华化学科技(江苏)有限公司；邻苯二甲酸氢钾、异丙醇、甲醇：中国医药集团上海化学试剂公司；无水乙醇、盐酸、氢氧化钠：南京化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备ZDJ-4A型自动电位滴定仪、PHS-3C型pH计：上海雷磁仪器有限公司；HH-S恒温水浴锅：金坛恒丰仪器厂；万分之一电子分析天平E11140：Ohau Corporation公司；DZF-6020型真空干燥箱、JB50-D增力电动搅拌机：上海标本模型厂；85-2型恒温磁动搅拌器：上海司乐仪器有限公司；TDZ4-WS台式低速自动平衡离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；RC-6型落地式高速冷冻离心机：美国Thermo公司；ZHWY-L-3B恒温培养振动器：上海智域分析仪器制造有限公司；LGJ-12型冷冻干燥机：北京松源科技发展有限公司；410型红外光谱仪：Nicolet Impact公司。

2实验方法

2.1O-CMC的制备方法

2.1.1壳聚糖C2位氨基的保护[8]精密称取3.0 g CTS溶于240 mL 1%醋酸溶液中，在25 ℃下完全溶解后慢慢加入180 mL甲醇。精密称取3.0 g苯甲醛溶于45 mL甲醇，均匀混合后逐滴加入，升温到60 ℃搅拌反应4 h。慢慢加入240 mL 5%NaOH溶液和60 ml甲醇，继续搅拌8 h。反应完后经抽滤沉淀依次用95%乙醇洗涤、无水乙醇脱水，除去未反应的苯甲醛，于55 ℃烘干。反应多次积累产品备用。

2.1.2羧甲基反应取上述产物5.0 g(过60目筛网)悬浮于50 mL异丙醇中，55 ℃溶胀5 h。冷却至25 ℃，在搅拌条件下慢慢滴加25 mL 25%NaOH溶液，速度为每滴3秒。滴加完毕后，继续搅拌1 h，使其充分混合，-20 ℃冷冻过夜。次日解冻后，在冰浴条件下，边搅拌边滴加20 mL异丙醇溶解的14 g氯乙酸，速度为5 s·d-1。滴加完毕后，在30 ℃搅拌反应2 h，再在70 ℃加热回流2 h。反应完后经抽滤去掉上清，沉淀依次用70%、60%乙醇分别洗涤数次后加200 mL蒸馏水溶解，离心去沉淀，用盐酸调pH值为中性，上清加乙醇至总体积的70%，析出产品。再用70%乙醇洗涤数次，无水乙醇脱水，55 ℃干燥得产品，备用。

2.1.3保护基团的去除将上述反应得到的产物用150 mL0.5 mol·L-1HCl室温浸泡48 h，用NaOH调pH值为中性，离心去沉淀。上清加乙醇至总体积的70%，析出产品，再用70%乙醇洗涤数次，无水乙醇脱水，55 ℃烘干得产品。

2.2O-CMC取代度的测定称取O-CMC样品0.1 g，精密称定、精确移取20 mL 0.1 mol·L-1HCl标准溶液充分溶解，用0.1 mol·L-1的NaOH标准液进行滴定，记录pH计读数变化。横坐标为消耗NaOH的体积，纵坐标为ΔpH/ΔV，利用二次微商法作图确定滴定终点。第一处的小突越是滴定过剩盐酸产生的，体积为V1；第二处的突越是滴定样品中的羧基产生的，体积为V2；第三处的突越是滴定样品中的氨基产生的，体积为V3。按下式计算取代度[9]：

DS=[0.203(V2-V1)×C(NaOH)]/(m-m1+m2)

m1=(V2-V1)×C(NaOH)×0.080-(V3-V0)×C(NaOH)×0.022

m2=(V3-V2)×C(NaOH)×0.042

式中：DS—取代度，%；

m—O-CMC样品的质量(扣除水分)，g；

m1—样品中总羧甲基(-CH2COOH，-CH2COONa)的质量，g；

m2—样品脱掉的乙酰基质量，g；

V0—相同体积标准HCl溶液空白滴定所需NaOH溶液的体积，mL；

V2-V1—滴定总羧基所消耗NaOH溶液的体积，mL；

V3-V2—滴定总氨基(RNH3+，R+NH2CH2COO-)所消耗NaOH溶液的体积，mL；

V3-V0—样品中游离羧甲基(-CH2COOH)所消耗NaOH溶液的体积，mL；

80—羧甲基钠(-CHCOONa)的相对分子质量，58—羧甲基(-CHCOOH)的相对分子质量，22=80-58；42—乙酰基(-COCH3)相对分子质量，203—AGA结构单元相对分子质量。

2.3O-CMC红外光谱分析称取O-CMC样品1 mg，与干燥的KBr粉末均匀混合，研磨压片，在400～4 000 cm-1范围内进行红外光谱扫描，记录红外光谱图。

3结果与分析

3.1反应条件对羧甲基反应的影响

3.1.1碱浓度对羧甲基反应的影响当羧甲基反应的反应介质为异丙醇，温度为70 ℃，M氯乙酸/M苯甲醛化的壳聚糖=2.8，NaOH溶液浓度分别为14.70%、20.00%、25.00%、30.00%，O-CMC的收率、取代度见表1。由表1可知：随着NaOH溶液浓度增加，产品的收率和取代度均先增加后减少，当NaOH溶液浓度为25%时，其收率和取代度均达到最大。天然的高分子中存在非结晶区与结晶区，NaOH可以破坏分子中的结晶区，使其充分溶胀，同时NaOH与苯甲醛化CTS分子中的羟基反应，形成碱化的活性中心，再与氯乙酸反应[10]。NaOH的用量将直接影响苯甲醛化的壳聚糖形成碱化的活性中心的数量，随着NaOH用量增大，形成的活性中心的数量增大，氯乙酸的利用率增高，有利于羧甲基反应的进行，产品收率和取代度均增大；但NaOH用量过大，副反应的发生率增高，氯乙酸的利用率降低，产品收率和取代度均降低[11]。

表1　碱浓度对O-CMC产品收率和取代度的影响

3.1.2氯乙酸的用量对羧甲基反应的影响当羧甲基反应的反应介质为异丙醇，温度为70 ℃，NaOH在反应液的终浓度为25%，M氯乙酸/M苯甲醛化的壳聚糖分别为1.0、2.0、2.8、3.5、4.5，O-CMC的收率、取代度见表2。由表2可知：随着氯乙酸用量增加，产品的收率和取代度均先增加后减少，当M氯乙酸/M苯甲醛化的壳聚糖=2.8时，其收率和取代度均达到最大。因为当NaOH用量一定时，形成的活性中心数量也一定，随着氯乙酸用量增加，其与活性中心发生碰撞机率增加，产品取代度增加；但当氯乙酸用量增至过量时，会中和一部分碱，促进副反应的发生，氯乙酸的利用率降低，产品收率和取代度均降低[12]。

表2　氯乙酸用量对O-CMC产品收率和取代度的影响

3.1.3温度对羧甲基反应的影响当羧甲基反应的反应介质为异丙醇，NaOH在反应液的终浓度为25%，M氯乙酸/M苯甲醛化的壳聚糖=2.8，温度为60 ℃、65 ℃、70 ℃，O-CMC的收率、取代度见表3。由表3可知：在一定范围内，随着温度增加，产品的收率和取代度逐渐增加。羧甲基反应是SN2反应(双分子亲核取代反应)，是由碱化的苯甲醛化壳聚糖进攻氯乙酸中的伯碳中心，温度升高则提供更多的能量使更多活性中心发生羧甲基反应，促进羧甲基反应的进行，从而提高产品的收率和取代度。

表3　反应温度对O-CMC产品收率和取代度的影响

3.2O-CMC的红外光谱分析O-CMC和CTS的红外光谱图分别见图1、2。由O-CMC的红外光谱图可知：1 606.0 cm-1和1 420.09 cm-1是羧甲基壳聚糖羧酸盐中-COO-对称及反对称伸缩振动的特征吸收峰。由于羧酸盐的分子中，其氧负离子含有一对孤对电子可与原来羰基的P电子发生共轭作用，形成一个三中心四电子的分子轨道，氧上负电荷分散在三个原子上，出现两个平均化的-CO结构，振动频率在C-O和C=O之间，红外吸收在υ 和υc=o之间，说明改性成功生成了CMC。3 435.4 cm-1为O-H和-NH2伸缩振动峰，与CTS相比该特征峰较窄，由于取代后的CMC中-OH或-NH2减少，则由缔合而形成氢键的数量减少，进一步说明-OH或-NH2上发生了取代反应。2 929.6 cm-1为C-H伸缩振动峰，1 326.8 cm-1为C-N振动峰，1 121.6 cm-1和1 061.5 m-1为C-O-C特征吸收峰。

图1　O-CMC红外光谱图

图2　CTS红外光谱图

4讨论

由于CTS分子链中C3和C6位有游离的-OH，C2位有游离-NH2，羧甲基反应在这3个位置均可以发生，可生成N,O-CMC、N-CMC和O-CMC。由于在碱性条件下羧甲基在羟基的取代活性大于氨基，同时C3上的取代反应受C2和C3之间的氢键作用与C3上位阻效应的影响，所以取代的羧甲基的含量O(C6)>N(C2)>O(C3)[13]。据文献报道[14]，只有当取代度≥1时，氨基上才会发生羧甲基取代反应，形成N,O-CMC。通过本方法制备的CMC，其测定的取代度均<1，是选择性较好、产物单一的O-CMC。

由实验结果可知：以异丙醇为反应介质，随着碱浓度、氯乙酸用量的增加，O-CMC的收率和取代度均先增加后减少；而在一定范围内其收率和取代度随着反应温度的增加而增加，当碱浓度为25.00%，M氯乙酸/M苯甲醛化的壳聚糖=2.8，反应温度为70 ℃时，O-CMC的收率和取代度达到最大，收率为30.74%，取代度为87.24%。克服了传统制备方法C6位选择性差、取代度低的缺点。

参考文献

[1]Muzzarelli RAA, Jeuniaux C,Gooday GW.Chitinin Nature and Technology[M].New York:Plenum Press,1986：215.

[2]吴迪,刘辉,浦金辉,等.羧甲基壳聚糖的生物特性及其在医药领域的应用[J].食品与药品,2013,15(3):210-212.

[3]宋宝珍,欧阳藩,张小勇,等.甲壳质、衍生物及其应用[M].北京:科学出版社,2010:16-17.

[4]王丽敏,刘振鸿.羧甲基壳聚糖的制备及在水处理中的应用研究进展[J].安徽化工,2006,136(4):8-10.

[5]张婷婷,杨爱,李志洲.羧甲基壳聚糖的研究及应用[J].化工技术与开发,2011,40(9):30-32.

[6]王美娜,李苑新,蔡兴.羧甲基壳聚糖的性能及应用概况[J].中国实验方剂学杂志,2015,21(1):228-232.

[7]王钦权,王远红,吕志华.O-羧甲基壳聚糖的制备及其结构表征[J].中国海洋大学学报,2011,41(S1):356-358.

[8]杨智宽,汪玉庭.全氮冠醚接枝壳聚糖的合成[J].化学试剂,1999,21(6)：323-325.

[9]刘长霞,陈国华,晋治涛.N,O-羧甲基壳聚糖羧化度计算式的修正[J].北京化工大学学报,2004,31(2):14-16.

[10] 王永娟.羧甲基壳聚糖的制备及应用研究[D].呼和浩特：内蒙古大学,2009：1-56.

[11] 索志勇.壳聚糖羧甲基化的过程研究[D].石家庄:河北科技大学,2011:1-58.

[12] 易喻,江威,王鸿,等.羧甲基壳聚糖的制备及性能研究[J].浙江工业大学学报,2011,39(1):16-20.

[13] 和圆圆,谢光银,关立平.羧甲基壳聚糖研究进展[J].浙江纺织服装职业技术学院学报,2014(1):22-27.

[14] 王洪振,赵传山,于淑慧.水溶性羧甲基壳聚糖的制备及其应用[J].华东纸业,2011,42(4):34-41.

Studies on preparation of O-carboxymethyl chitosan

LI Qiu-ping

(ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing,Jiangsu211198,China)

Abstract:Objective To obtain the highly yield and substitution of C2in O-CMC, the amino of chitosan reacted with benzaldehyde to form imides.Methods Carboxymethylation was conducted in alkaline condition and benzaldehyde was removed in acidic condition to form O-CMC.The yield and substitution degree were regarded as assessment indexes.The effects of reaction conditions were evaluated on carboxymethylation by the single factor test,including the concentration of alkali,the dosage of chloroacetic acid,and the temperature of reaction. Results 25% alkali concentration,Chloroacetic acid/Benzaldehyde of Chitosan(m/m) equaled 2.8 and 70 ℃ reaction temperature were considered as optimum reaction conditions.Conclusions The highly yield and substitution of O-CMC was obtained under the optimal reaction conditions.

Key words:Chitosan;Drug compounding

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.06.007

(收稿日期：2015-11-16，修回日期：2016-02-10)