变黄期阶梯升温烘烤工艺对多酚类及相关物质的影响

王爱华，王松峰，孙福山*，黄明迪，王耀锋，杨树勋，赵存孝，夏 巍，乔万鹏，王希玲（.中国农业科学院烟草研究所，青岛 660；.甘肃陇南市烟草公司，甘肃 陇南 76000；.甘肃庆阳市烟草公司，甘肃庆阳 75000；.山东临沂烟草有限公司沂水分公司，山东 沂水 7600）



变黄期阶梯升温烘烤工艺对多酚类及相关物质的影响

王爱华1，王松峰1，孙福山1*，黄明迪2，王耀锋3，杨树勋2，赵存孝3，夏 巍2，乔万鹏2，王希玲4
（1.中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101；2.甘肃陇南市烟草公司，甘肃 陇南 746000；3.甘肃庆阳市烟草公司，甘肃庆阳 745000；4.山东临沂烟草有限公司沂水分公司，山东 沂水 276400）

摘 要：采用电热式温湿度自控密集烤烟箱，研究了变黄期阶梯升温烘烤工艺对多酚类物质、相关酶活性及含氮化合物的影响。结果表明，密集烘烤过程中，各烘烤工艺的总酚、绿原酸、咖啡酸和芸香苷含量总体上均呈上升趋势。除烘烤变筋期，变黄期阶梯升温烘烤工艺的总酚和绿原酸含量高于对照。咖啡酸、芸香苷、莨菪亭等含量在烘烤过程中变化各不相同，烘烤结束两工艺差异较小。棕色化反应的敏感期，变黄期阶梯升温烘烤工艺的多酚氧化酶（PPO）活性较低；烘烤期间，该工艺的过氧化物酶（POD）活性明显高于对照。烘烤过程中，变黄期阶梯升温烘烤工艺的苯丙氨酸和酪氨酸均表现出“降-升-降”的趋势；烘烤中后期，变黄期阶梯升温烘烤工艺的蛋白质降解得较低，而两种氨酸含量则较高。总之，变黄期阶梯升温烘烤工艺有利于烤后烟叶总酚、绿原酸含量和芳香值的提高，利于蛋白质的降解及苯丙氨酸和酪氨酸的积累。

关键词：变黄期阶梯升温；密集烘烤工艺；多酚类物质；酶活性；氨基酸

多酚在烟草的调制特性，色泽和等级，以及烟气香味等各个方面起着重要作用，是衡量烟草品质的一个重要因素，因而在提高烟叶品质的研究中，多酚类物质的重要性是不容忽视的。以往的研究大都关注苯丙烷类物质和相关酶在抗病反应中的作用，前人还对生长发育过程中烟叶多酚物质含量水平的变化进行过探讨，关于某些栽培因子以及品种和成熟度对烤烟烟叶多酚类物质含量的影响也进行了一些研究［1-7］，而目前针对烘烤过程中次生代谢的研究缺乏，关于密集烘烤工艺对多酚类物质的影响的研究更少［8-11］。本研究通过研究变黄期阶梯升温烘烤工艺对多酚类物质、相关酶活性和含氮化合物的影响，进一步丰富多酚代谢理论，对于防止烟叶发生酶促棕色化反应，从根本上提高烟叶品质也具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究试验于 2014年在中国农业科学院烟草研究所进行，以诸城市贾悦镇大田长势长相良好的优质烟叶供试，品种为中烟100。土壤类型为褐土，肥力中等。采收成熟一致的中部叶（9～11叶位）在智能化自控电烤箱中进行烘烤。

1.2 试验处理

按烟叶变黄温度、变黄程度和定色温度不同，设置2个处理，分别为G1和G2，处理G1为对照，处理G2为变黄期阶梯升温烘烤工艺，具体见表1。表1中“变片”指烘烤过程中烟叶完成主要变黄，变黄 7～8成，片软；“变筋”指烟筋变黄，达到黄片黄筋；“干片”指烟叶叶片完全干燥。

1.3 试验要求

在烘烤期间烟叶变化的关键阶段（鲜烟、变片、凋萎、变筋、干片、干筋）末期取样，样品分成两部分，一部分用于PPO和POD活性的测定，一部分杀青后用作多酚类、蛋白质、苯丙氨酸和酪氨酸含量测定。烘烤工艺关键点按照设置进行，其他操作技术均依常规密集烘烤工艺进行。

1.4 测定内容和方法

绿原酸、咖啡酸、芸香苷、槲皮素、莨菪亭和七叶亭等多酚类物质含量测定采用 YC/T 202—2006标准；总酚含量为检测出的各多酚类物质的总和；芳香值用多酚物质总量与蛋白质氮含量的比值表示。PPO活性采用邻苯二酚氧化法测定［12］；POD活性用愈创木酚氧化法测定［13］，以每分钟 OD470变化值表示酶活性大小。蛋白质含量采用YC/T166 —2003；苯丙氨酸和酪氨酸含量采用水解并衍生化后液相色谱仪测定。

2 结 果

2.1 变黄期阶梯升温工艺对多酚类的影响

2.1.1 对总酚的影响 由图1可知，各烘烤工艺处理总酚在烘烤过程中总体呈上升趋势，处理G1在干片末期之后总酚含量稍有下降。整个烘烤过程中，处理G2的总酚含量高于G1，且在干片之后，差异表现较明显。干筋期烟叶总酚含量显著高于鲜烟叶。

2.1.2 对绿原酸的影响 本试验烘烤过程及烘烤结束，绿原酸含量占总酚含量变化范围为62.45%～84.22%（图2）；处理G1和G2的总酚与绿原酸相关系数分别为0.997**和0.994**，均达到极显著正相关。烘烤过程中，各烘烤工艺处理绿原酸含量变化规律与总酚相同，均呈现出整体上升趋势，烘烤后期有波动。鲜烟至凋萎末期，各处理均呈逐渐升高趋势，处理G2略高于处理G1；变筋末期，两个处理的绿原酸含量差异较小，处理G1的绿原酸含量略高于处理G2；变筋末期之后，处理G2绿原酸含量仍持续升高，而处理G1稍有降低，此阶段，处理G2绿原酸含量高于处理G1。

表1 不同处理关键温度点指标参数Table 1 Index parameter of key temperatures under different treatments

图1 变黄期阶梯升温工艺对总酚的影响Fig.1 Effects of step-temperature yellowing technology on total phenols

图2 变黄期阶梯升温工艺对绿原酸的影响Fig.2 Effects of step-temperature yellowing technology on chlorogenic acid

2.1.3 对咖啡酸的影响 各处理烤后咖啡酸含量明显高于鲜烟叶，且总体上均表现出烘烤前中期先升高，之后稍有降低的趋势（图3）。鲜烟至凋萎末期，处理G2的咖啡酸含量升高迅速，处理G1的升幅则较小，处理G2明显高于处理G1；变筋末期至干片末期，处理G1的咖啡酸上升幅度大，高于处理G2；进入干筋期，由于处理G1咖啡酸含量降低，因此，烘烤结束处理G2的咖啡酸含量略微高于处理G1。

图3 变黄期阶梯升温工艺对咖啡酸的影响Fig.3 Effects of step-temperature yellowing technology on caffeic acid

2.1.4 对芸香苷和槲皮素的影响 各工艺处理烤后芸香苷含量明显高于鲜烟叶（图4）。处理G1在变黄和定色期呈升高趋势，进入干筋期又有所下降；处理G2在烘烤过程中则一直呈升高趋势。鲜烟至凋萎末期，处理G2的芸香苷含量高于处理G1；进入定色期之后，处理G1的芸香苷含量上升较快，则高于处理G2。

各烘烤工艺处理的槲皮素含量较低（图5）。槲皮素在烘烤过程变化较波折，具体表现为：处理G1的槲皮素含量先升高至变片末期，之后下降至变筋末期，干片期有所回升，进入干筋期急剧下降；处理G2的槲皮素含量先升高至凋萎末期，之后再迅速降低至烘烤结束。变黄前期和干筋期，处理G1的槲皮素含量高于处理G2，而变黄中后期和定色期，则表现相反。

2.1.5 对莨菪亭和七叶亭的影响 由图6可知，烘烤过程中，处理 G1的莨菪亭含量表现为“升-降-升”的趋势，且在变片末期出现峰值，于干片末期达到最小值；处理G2的莨菪亭含量总体呈先升高后降低的趋势，也于变片末期达到最高值。鲜烟至凋萎末期和干筋末期，处理G1的莨菪亭含量高于处理 G2；凋萎末期至干片末期，则表现相反。烘烤过程中，各处理七叶亭变化趋势大致呈倒“V”型变化；除变筋末期，处理G2明显高于处理G1，其他时期差异不太显著。（图7）。

2.2 变黄期阶梯升温工艺对相关酶活性的影响

2.2.1 对多酚氧化酶（PPO）活性的影响 多酚氧化酶是一类广泛存在于植物体内的含铜金属酶类，是呼吸链末端氧化酶之一，在氧的存在下，儿茶酚、花色素、绿原酸等单酚和多酚，均能被其催化而氧化，且在调制过程中由于多酚氧化酶的催化会使烟叶发生棕色化反应。由图8可知，随着烘烤进程的推进，各处理的 PPO活性变化总体呈现下降的趋势。比较各处理PPO活性，在变筋末期之前，处理G2低于处理G1；变筋末期之后，各处理酶活性差异不大，且活性较微弱。

2.2.2 对过氧化物酶（POD）活性的影响 过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶类，主要存在于细胞的过氧化物酶体中，可以催化酚类物质的氧化。从测定结果看（图 9），POD随着烘烤时间的推进，其活性升高，在凋萎末期达到最高值，之后急剧下降，干筋期酶活性几乎全部丧失。烘烤过程中，处理G2的POD活性明显高于处理G1。

2.3 变黄期阶梯升温工艺对相关含氮化合物的影响

2.3.1 变黄期阶梯升温工艺对蛋白质的影响 随着烘烤的进行，蛋白质逐渐降解。变黄期处理 G2的蛋白质含量高于G1；变筋末期之后，处理G2蛋白质含量则较低（图10）。

图4 变黄期阶梯升温工艺对芸香苷的影响Fig.4 Effects of step-temperature yellowing technology on rutin

图6 变黄期阶梯升温工艺对莨菪亭的影响Fig.6 Effects of step-temperature yellowing technology on scopoletin

图5 变黄期阶梯升温工艺对槲皮素的影响Fig.5 Effects of step-temperature yellowing technology on meletin

图7 变黄期阶梯升温工艺对七叶亭的影响Fig.7 Effects of step-temperature yellowing technology on esculetin

2.3.2 变黄期阶梯升温工艺对相关氨基酸的影响

随着烘烤进程的推进，处理G1的苯丙氨酸含量先稍降至变片末期，再升高至变筋末期，之后又降低至干筋末期（图11）；处理G2先升高至凋萎末期，稍有下降后又继续升至干片末期，之后又降低。除变筋末期，处理G2的苯丙氨酸含量高于处理G1。烘烤过程中，处理G1和G2的酪氨酸含量均表现出先下降后升高又下降的大致趋势，且最低值均在变片末期，最高值则分别出现在凋萎末期、干片末期（图12）。处理G2在烘烤过程中的酪氨酸含量均高于处理G1。

2.4 变黄期阶梯升温工艺对烤后多酚和芳香值的影响

多酚类化合物被作为衡量烟草质量的一个因素，并提出把多酚物质含量与蛋白质氮含量的比值即“芳香值”作为判断烟草中香气吃味的依据［14］。由表2可知，处理G2烤后烟叶的芳香值高于G1，因此，处理G2的香气和评吸质量将好于处理G1。处理G2的绿原酸和总酚含量高于G1，咖啡酸、芸香苷、莨菪亭等含量几乎无差异。

图8 变黄期阶梯升温工艺对PPO活性的影响Fig.8 Effects of step-temperature yellowing technology on PPO

图10 变黄期阶梯升温工艺对蛋白质的影响Fig.10 Effects of step-temperature yellowing technology on proteins

图12 变黄期阶梯升温工艺对酪氨酸的影响Fig.12 Effects of step-temperature yellowing technology on tyrosine

3 讨 论

3.1 烘烤工艺对多酚类物质、相关酶活性和芳香值的影响

密集烘烤过程中，各工艺处理的总酚、绿原酸、咖啡酸和芸香苷含量总体上均呈上升趋势，烤后烟叶高于鲜烟叶。烘烤过程除变筋期，处理G2的总酚和绿原酸含量高于 G1，且在干筋期，差异较明显。咖啡酸、芸香苷、槲皮素、莨菪亭和七叶亭含量在烘烤过程中变化各不相同，烘烤结束，各工艺处理差异较小。

图9 变黄期阶梯升温工艺对POD活性的影响Fig.9 Effects of step-temperature yellowing technology on POD

图11 变黄期阶梯升温工艺对苯丙氨酸的影响Fig.11 Effects of step-temperature yellowing technology on phenylalanine

多酚氧化酶是烟叶调制过程中决定烟叶色泽的重要酶类，调制不当，它可氧化各种酚类物质生成醌，再经聚合成黑色素，导致棕色化反应。POD是一类以血红素为辅基的酶，具有不同的生物功能，主要催化 H2O2和有机过氧化物，加速多种有机物和无机物的氧化，清除活性氧，也参与酚类物质的氧化，所以，有人认为PPO、POD、酚类可构成一个体系表现出植物对逆境或成熟及衰老进程的反应［14］。随着烘烤进程的推进，各处理的 PPO活性变化总体呈现下降的趋势；而 POD则表现出先升高后降低的趋势，峰值出现在变黄末期。棕色化反应的敏感时期（45～47 ℃），工艺处理 G2的PPO活性低于G1。烘烤过程中，处理G2的POD活性明显较高。

变黄期阶梯升温烘烤工艺（处理 G2）烤后烟叶总酚、绿原酸含量和芳香值较高；烘烤过程中，该工艺较低的PPO活性不易发生棕色化反应，而较高的POD活性，因可能是由于处理G2采用了阶梯升温变黄工艺，变黄期设置了4个稳温阶段，符合生理生化变化规律；利于烘烤过程中烟叶 PPO、POD等生理指标向有益的方向进行，利于多酚类的积累，也将利于香气和评吸质量的提高。

表2 烤后烟叶多酚类物质含量及芳香值Table 2 Polyphenol substance contents and aroma values of cured tobacco leaves

3.2 烘烤工艺对相关含氮化合物的影响

烟草多酚类的合成由芳香族氨基酸（包括苯丙氨酸、酪氨酸等）脱氨经由肉桂酸和香豆素形成的，一些关键化合物如莽草酸和奎尼酸在烟草中都存在。随着烘烤的进行，蛋白质逐渐降解；变筋末期之后，处理G2蛋白质含量则较低。烘烤过程中，处理G2的苯丙氨酸表现大致“M”趋势，而处理G2的酪氨酸及处理G1的两种氨基酸均表现出“降-升-降”的趋势，且均在变片期（变黄7～8成之前）有降低趋势。总体上，处理G2在烘烤过程中的苯丙氨酸和酪氨酸含量均高于处理G1。

在烟叶调制过程中，蛋白质降解，苯丙氨酸和酪氨酸含量应增加，而在变片期，处理G2的酪氨酸及处理G1的两种氨基酸则降低较明显，而美拉德反应一般发生在50～55 ℃温度下激烈进行，这表明苯丙氨酸和酪氨酸在变片期可能参与了其他生化反应，是否与多酚类物质有关，有待进一步研究解决。

4 结 论

变黄期阶梯升温烘烤工艺烤后烟叶总酚、绿原酸含量和芳香值较高；烘烤过程中，该工艺不易发生棕色化反应，利于烟叶内含物质的分解转化，其间接影响烟叶品质。变黄期阶梯升温烘烤工艺利于蛋白质的降解和苯丙氨酸以及酪氨酸的积累。

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Effects of the Step-temperature Yellowing Curing Technology on Polyphenol and Related Substance in Tobacco Leaves

WANG Aihua1， WANG Songfeng1， SUN Fushan1*， HUANG Mingdi2， WANG Yaofeng3， YANG Shuxun2，ZHAO Cunxiao3， XIA Wei2， QIAO Wanpeng2， WANG Xiling4
（1.Tobacco Research Institute of CAAS， Qingdao 266101， China； 2.Tobacco Company in Longnan， Longnan， Gansu 746000， China；3.Tobacco Company in Qingyang， Qingyang， Gansu 745000， China； 4.Linyi Tobacco Company of Shandong Province， Yinshui Branch 276400， China）

Abstract:Effects of the step-temperature yellowing curing technology on polyphenol， related enzyme activities and nitrogen compounds in tobacco leaves were studied using electric-heated flue-curing barn.The results showed that contents of total phenols，chlorogenic acid， caffeic acid and rutin increased during all bulk curing processes.Total phenols and chlorogenic acid contents of the step-temperature yellowing technology were higher than control except at the muscle-yellowing temperature stage.The contents of caffeic acid， rutin and scopoletin changed differently between the two technologies， but little difference was detected at the end of curing.Lower Polyphenol oxidase（PPO）activity during the sensitive period of the brown reaction and significantly higher Peroxidase（POD） activity during curing were observed for the step-temperature yellowing technology.With the step-temperature yellowing technology， the changes of phenylalanine and tyrosine of the showed a down-up-down trend during curing， lower proteins content and higher phenylalanine and tyrosine contents in middle and late curing period were observed.In short， the step-temperature yellowing technology was beneficial in improving the contents of total phenols， chlorogenic acid and aroma values， and was also favorable to protein decomposition and accumulation of phenylalanine and tyrosine.

Keywords:step-temperature yellowing； bulk curing technology； polyphenol substances； enzymatic activity； amino acids

中图分类号：S572.01

文章编号：1007-5119（2016）02-0059-07

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.02.011

基金项目：中国农业科学院作物科学研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（2014 JB01-005）；甘肃省烟草专卖局（公司）科技计划项目“甘肃陇南特色优质烟叶研究与开发”（20130089）；“甘肃庆阳特色优质烟叶研究与开发”（QYYCKJ2013-001）；中国烟草总公司四川省公司科技项目（SCYC201402004）

作者简介：王爱华，女，硕士，助理研究员，主要从事烟草调制加工研究。E-mail：wangaihua@caas.cn。*通信作者，E-mail：sunfushan@caas.cn

收稿日期：2015-05-11 修回日期：2016-03-23