重庆丰都烟区田间烟草病毒病及其Dot-ELISA检测

时洪伟，刘陈晨，李 科，孙 淼，代先强，马冠华，青 玲*（.西南大学植物保护学院，植物病害生物学重庆市高校级重点实验室，重庆 北碚 40076；.重庆市丰都县烟草专卖局，重庆 丰都 404000）



重庆丰都烟区田间烟草病毒病及其Dot-ELISA检测

时洪伟1，刘陈晨1，李 科1，孙 淼1，代先强2，马冠华1，青 玲1*
（1.西南大学植物保护学院，植物病害生物学重庆市高校级重点实验室，重庆 北碚 400716；2.重庆市丰都县烟草专卖局，重庆 丰都 404000）

摘 要：为明确重庆市丰都烟区田间烟草病毒病的发生情况，开展了病毒病调查，并于还苗期、伸根期、旺长期和成熟期共采集病毒病样品117份，利用TMV、CMV、PVY、TEV、PVX、TuMV和BBWV-2等7种病毒的特异性抗体对其进行Dot-ELISA检测。调查发现，病毒病症状主要包括花叶、畸形、坏死斑、脉坏死、矮化和蚀纹等类型。9个调查点烟草病毒病的发病率在28%～84%，病情指数最低为6.67，最高为60.89。Dot-ELISA检测结果表明，还苗期样品未检出病毒；伸根期没有检测到PVX；旺长期和成熟期均检测到7种病毒，其中TMV和CMV的检出率较高，其次为TuMV和PVY，PVX的检出率较低。此结果表明，烟草病毒病在丰都烟区发生较普遍，且TMV和CMV为田间烟草病毒病的优势毒源。

关键词：烟草病毒病，病毒种类，Dot-ELISA检测

烟草病毒病是全世界烟草种植区的重要病害之一，严重影响烟草的产量和品质。世界范围内常见的烟草病毒种类约 20余种，主要包括烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus， TMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mo saic virus， CMV）、烟草曲茎病毒（Tobacco curly shoot virus， TbCSV）、中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yel low leaf curl Chi na virus， TYLCCNV）等［1-5］。随着气候、耕作方式的改变，烟草病毒病的危害程度和侵染烟草的病毒种类也在不断发生变化，在我国广西、云南和重庆等烟区相继发现了一些新的病毒种类，如番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus， TSWV）、芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus， TuMV）和番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus， ToMV）［2，6-12］。

近年来，重庆烟区烟草病毒病的发生呈逐年加重的趋势，且病毒复合侵染现象严重，导致烟叶的产量和质量下降，严重制约烟叶生产发展。已有报道利用酶联免疫吸附测定法（ELISA）从重庆武隆地区烟草上检测到CMV、TMV、TuMV及马铃薯Y病毒（Potato virus Y， PVY）4种病毒；从重庆黔江、酉阳、南川及涪陵地区烟草上鉴定到 CMV、TuMV、TMV、PVY及ToMV 5种病毒；从涪陵、彭水、万州、黔江、武隆和酉阳地区检测到CMV、PVY、TMV、TEV（Tobacco etch virus， TEV）、TuMV、BBWV-2（Broad bean wilt virus 2， BBWV-2）和马铃薯X病毒（Potato virus X， PVX）等7种病毒［2，12-14］。丰都县是重庆市重要的烟草种植区，目前该地区烟草病毒病发生情况还没有相关报道。为了摸清该烟区烟草病毒病发生情况及烟草病毒种类，以及病毒复合侵染情况，分别于烟草还苗期（从移栽到成活）、伸根期（从成活到团棵）、旺长期（从团棵到现蕾）和成熟期（从现蕾到烟叶采收结束）对丰都烟区开展了烟草病毒病田间调查，并利用斑点杂交法（Dot-ELISA）对田间采集样本进行了检测，以期为该地区烟草病毒病的综合防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病害调查地点

2013年在重庆市丰都县7个镇的9个烟叶种植点进行田间病毒病害调查，9个调查点分别为南天湖镇三抚乡、暨龙镇回龙场、太平镇关山、双路镇莲花村、三坝乡厢坝、三坝乡野桃坝、三坝乡碾场坝、包鸾镇文家坝和高家镇方斗山。

1.2 田间调查及数据计算

于烟草病毒病发病盛期在丰都县烟区9个调查点分别选取1块烟田，采用5点取样方法，每块烟田调查50株，采用GB/T 23222—2008烟草病虫害分级标准［15］，对调查烟株进行病害分级，按如下公式分别计算病株率和病情指数：

发病率/%=发病株数/调查总株数×100%；

病情指数=［Σ（各级病株数×该病级值）/（调查总株数或叶数×最高级值）］×100。

1.3 样品采集

丰都烟区的主栽品种为云烟87。在丰都县高家镇方斗山调查点于烟草还苗期、伸根期、旺长期和成熟期共采集病毒病样品117份用于检测，其中还苗期样品3份，伸根期样品38份，旺长期样品38份，成熟期样品38份，于实验室-80 ℃冰箱保存。

1.4 标准抗原和抗体

TMV、CMV、BBWV-2和TuMV相应抗原及单克隆抗体由浙江大学生物技术研究所周雪平教授惠赠，TEV和PVX购自ADGEN，PVY的抗原及多克隆抗体由本实验室保存，碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG及羊抗兔IgG购自美国Promega公司。

1.5 Dot-ELISA检测

参考郭思瑶等［16］的方法进行Dot-ELISA检测。将采集到的烟草样品每次每份取 0.1g，按 m/v=1g/10 mL分别加1mol/L PBS研磨，8000r/min离心3min，取2 μL上清液点到硝酸纤维素膜（NC膜）上，每个样品点3个点作为重复。室温干燥10min后，将NC膜浸入含5%脱脂奶粉缓冲液中，室温封闭30min。然后将NC膜放入1：5000倍稀释的单克隆抗体中室温孵育30～60min，PBST洗膜3～4次，每次3min。将NC膜放入用5%的脱脂奶粉1：8000倍稀释的碱性磷酸酶标记羊抗鼠 IgG中室温孵育30～60min；然后PBST洗膜4～5次。显色底物NBT 66 μL和BCIP 33 μL加到10 mL底物缓冲液中混匀，洗好的膜用滤纸吸干后放入底物显色液中反应，待阳性对照呈现明显紫色，而阴性对照呈现淡绿色，空白对照没有任何颜色显示时终止反应（显色5～20min），随即在自来水中漂洗一下，观察并记录结果。

2 结 果

2.1 烟草病毒病田间症状

在重庆丰都烟区9个调查点进行病毒病调查，结果发现田间烟草病毒病症状可分为以下6种类型（图1）：A花叶：叶片局部褪绿黄化，部分颜色变深；B叶片畸形：叶片扭曲皱缩，叶面变窄，叶尖变细，叶面出现疱斑；C脉坏死：叶脉褐色坏死，症状首先从支脉表现，发展到主脉，严重时叶片从下到上依次黄化萎蔫，最后整株死亡；D蚀纹：叶面出现点状白色线条或不规则环状线；E植株矮化：该症状常与其他症状同时表现，尤其是和坏死及畸形等症状相伴随；F坏死斑：叶面会先出现褐色坏死环斑，可沿主侧脉进一步扩展呈深褐色闪电状坏死斑。

图1 重庆丰都烟草病毒病症状Fig.1 Symptoms on tobacco in Fengdu county of Chongqing

2.2 田间病害调查

在丰都烟区9个调查点共调查450棵烟株，以株为单位进行分级调查，采用国家标准（GB/T23222—2008）将烟草花叶病毒病划分为1、3、5、7和9级。调查发现，450棵烟株中有189棵为0级，全株无病；70棵为1级，呈轻微花叶症状；56棵为3级，三分之一叶片呈花叶但不变形；52棵为 5级，呈花叶且少数叶片变形；28棵为 7级，表现侧脉坏死或者二分之一至三分之二叶片呈花叶症状；55棵为9级，全株叶片呈花叶症状，严重变形或坏死（表1）。

对丰都烟区9个调查点烟草病毒病的发病率进行分析（表 1），暨龙镇回龙场的发病率最低，为28%，在调查的50棵烟株中有36棵未发病；三坝乡野桃坝发病率最高，为84%，仅8株未发病。病情指数分析表明，南天湖镇病情指数最低，仅为6.67；高家镇方斗山病情指数最高，为60.89。其他调查点的病情指数均低于40。

表1 丰都县烟草病毒病调查结果Table 1 Results of virus disease survey in Fengdu county

2.3 Dot-ELISA检测

2.3.1 病毒种类检测 利用TMV、CMV、PVY、PVX、TEV、TuMV及BBWV-2等7种病毒的特异性血清对田间采集的不同生育期的烟草样品进行了Dot-ELISA检测（图2）。结果表明，烟草还苗期采集的3份样品均未检测到这7种病毒（表2）。在伸根期采集的样品中，TMV的检出率最高，为60.53%；其次为 CMV和TuMV，分别 44.74%和36.84%。在旺长期样品中，TMV和CMV的检出率均较高，分别为55.26%和47.37%。在成熟期样品中，CMV的检出率最高，为52.63%。

随着烟草生育期的变化，7种病毒的阳性检出率也有所变化（表2）。其中CMV、PVY和TEV 这3种病毒的阳性检出率随着时间推移而上升，且上升幅度较大；TMV和TuMV阳性检出率前期高，到成熟期有所下降，TMV下降为47.37%，TuMV阳性检出率下降幅度较大，从伸根期的36.84%降到5.26%。BBWV-2的检出率从伸根期开始就没有发生变化，PVX到旺长期已趋于稳定。

图2 烟草样品的Dot-ELISA检测结果Fig.2 Dot-ELISA result of tobacco samples

表2 烟草不同生育期的病毒种类检测Table 2 Detection of virus types infecting tobacco at different growth stages

2.3.2 病毒复合侵染分析 表3检测结果发现，在117份样品中有82份烟草样品与7种病毒供试血清中的一种或多种发生阳性反应，其中有 62份烟草样品检出两种或两种以上病毒的复合侵染。共有20种复合侵染类型，其中两种病毒的复合侵染有8种类型，占 62.90%；3种病毒侵染有 6种类型，占24.19%；4种病毒侵染有3种类型，占8.06%；5种病毒侵染有2种类型，占3.23%；6种病毒侵染的类型仅1种，为CMV+TMV+PVY+TuMV+ BBWV-2+TEV。在病毒复合侵染类型中，CMV+TMV所占比例最高，占37.10%。

表3 烟草样品的病毒复合侵染类型和比例Table 3 Infection types and percentage of viruses on tobacco

3 讨 论

本研究在重庆丰都烟区9个调查点进行了烟草病毒病田间调查和Dot-ELISA检测，调查发现，烟草病毒病发生普遍，但9个调查点的发病程度有所不同。其中，三坝乡野桃坝发病率最高，为84%，但由于病株主要集中在1级和3级，因而总体发病较轻；高家镇方斗山虽发病率较低，但病株大多为9级，故发病程度较严重，病情指数高达60.89。

Dot-ELISA是在酶联免疫吸附测定法（ELISA）的基础上以纤维素膜代替聚丙乙烯微量反应板而建立的一种免疫检测方法。该方法不仅保留了ELISA快速灵敏的优点，而且还可弥补抗原或抗体在载体上包被不牢固等缺点，具有敏感性高、特异性强、被检样品用量少、节约试剂材料等优点，已广泛应用于植物病毒的检测［13］。已有报道在重庆烟草上检出TMV、CMV、PVY、PVX、TEV、TuMV 及 BBWV-2等病毒［1，9-11］，本研究运用 Dot-ELISA技术从丰都烟草样品中也检出了这7种病毒，其中，TMV和CMV是侵染该地区烟草的主要病毒种类，属优势毒原；PVY、TEV及TuMV为次要病毒种类，PVX及BBWV-2危害较小。且TMV和CMV的复合侵染所占比例最高，病株表现花叶、叶片皱缩、扭曲等不同症状，严重影响烟叶的产量和质量。

田间调查发现烟草病毒病症状主要包括花叶、畸形、坏死环斑、脉坏死和蚀纹等多种类型。在本研究中，将样品症状和Dot-ELISA检测结果相结合进行分析发现，检测结果显示受 PVY单独侵染的不同烟株表现出典型花叶、茎及叶脉坏死及叶片皱缩等多种症状，说明一种病毒侵染烟草也能引起多种症状表现。

结合田间调查和检测结果可见，烟草病毒病目前仍是丰都烟草上的重要病害，由于生产上还缺乏有效的防治药剂，因而需高度重视，加强对病毒病的田间监控，及时清除病株，并控制介体蚜虫的数量，尽可能减少病害造成的损失。本研究虽已明确了TMV、CMV、PVY、PVX、TEV、TuMV及BBWV-2在重庆丰都的发生、分布和侵染情况，为丰都烟区病毒病的防治工作提供了依据，但由于仅应用了这7种病毒的供试血清对样品进行Dot-ELISA检测，因而重庆丰都烟草上是否还存在其他病毒种类的侵染还需作进一步检测。

4 结 论

重庆市丰都烟区田间烟草病毒病发生普遍，症状类型多样，共检出TMV、CMV、PVY、PVX、TEV、TuMV及BBWV-2等7种植物病毒，其中TMV和CMV为优势毒源，该地区应以TMV和CMV为主要靶标，有针对性的制定相应防控措施。

参考文献

［1］ 罗红香，李余湘，刘会忠，等.贵州黔南烟草马铃薯Y病毒（PVY）株系的血清学鉴定［J］.中国烟草科学，2012，33（5）：60-62.

［2］ 青玲，刘映红，马丽娜.武隆烟区烟草病毒病的病原初步鉴定［J］.西南农业大学学报，2005，27（3）：319-322.

［3］ 许汝冰，李锡宏，雎韡，等.马里兰烟病毒病症状类型、毒源种类及病毒侵染构型研究［J］.中国烟草科学，2014，35（4）：85-87

［4］ Xie Y， Zhou X， Li G.Molecular characterization of Tomato yellow leaf curl China virus and its satellite DNA isolated from tobacco［J］.Chinese Science Bulletin，2003， 48（8）： 766-770.

［5］ Xie Y， Zhou X， Zhang Z， et al.Tobacco curly shoot virus isolated in Yunnan is a distinct species of Begomovirus［J］.Chinese Science Bulletin， 2002， 47（3）：199-201.

［6］ 佟爱仔，赵兴能，孔宝华，等.侵染云南烟草的番茄斑萎病毒（TSWV）的 RT-PCR检测［J］.云南农业大学学报：自然科学，2012，27（6）：809-813.

［7］ 蒙姣荣，赵家新，蔡琦，等.广西烟草病毒病发生情况调查和病原病毒的鉴定［J］.广西植保，2012，25（4）：1-2.

［8］ 张仲凯，丁铭，方琦，等.番茄斑萎病毒属（Tospovirus）病毒在云南的发生分布研究初报［J］.西南农业学报，2004，17（增刊）：163-168.

［9］ 刘雅婷，卢秀萍，郑元仙，等.云南烟草上出现番茄斑萎病毒（Tospovirus）属病毒［J］.中国烟草学报，2009，14（6）：53-56.

［10］ Dong J H， Yin Y Y， Xu X Y， et al.First report of Tomato spotted wilt virus in tomato and tobacco in China［J］.Journal of Plant Pathology， 2010， 92 （4S）：S122.

［11］李刚，李现道，赵黎明，等.山东烟草番茄黄化曲叶病毒的分子检测和序列分析［J］.中国烟草科学，2013，34（6）：98-102.

［12］青玲，牛颜冰，吴楚钊，等.部分烟区烟草病毒病病原检测及复合侵染分析［J］.烟草科技，2009（12）：58-64.

［13］宋娟，廖秋菊.重庆烟草地区ELISA检测［J］.生物技术世界，2014（1）：143-144.

［14］杨会房.重庆烟草病毒病病原种类鉴定及快速检测技术研究［D］.重庆：西南大学硕士，2013.

［15］任广伟，孔凡玉，王凤龙.GB/T 23222—2008烟草病害分级及调查方法［J］.北京：中国标准出版社出版，2008.［16］郭思瑶，童艳，黄娅，等.重庆辣椒病毒病病原初步鉴定和分析［J］.园艺学报，2015，42（2）：263-270.

Detection of Field Viral Diseases on Tobacco in Fengdu County of Chongqing with the Dot-ELISA Technique

SHI Hongwei1， LIU Chenchen1， LI Ke1， SUN Miao1， DAI Xianqiang2， MA Guanhua1， QING Ling1*
（1.Chongqing Key Laboratory of Plant Disease Biology， College of Plant Protection， Southwest University， Beibei， Chongqing 400716， China； 2.Fengdu Tobacoo Monopoly Administration， Fengdu， Chongqing 404000， China）

Abstract:In order to survey the occurrence of tobacco viral diseases in Fengdu， Chongqing， 117 tobacco leaf samples with viral symptoms were collected at different growth stages （seeding， stem elongation， vigorous growing and mature） and detected with the Dot-ELISA technique using the specific antibodies against 7 viruses including TMV， CMV， PVY， TEV， PVX， TuMV and BBWV-2.Field investigation showed that virus-induced symptoms of tobacco include mosaic， leaf malformation， necrotic rings， vein necrosis，dwarf and etch.The incidence of tobacco virus diseases at nine survey spots is between 28%-84% and the disease index is between 6.67-60.89.The results revealed that no virus was detectable in samples at the seeding stage and PVX was undetectable in samples at the elongating stage.All of the 7 viruses were detected at the late growth stages.Both TMV and CMV had higher detection ratios than those of TuMV and PVY while PVX had the lowest detection ratio.These results showed that tobacco viral diseases commonly occur in Fengdu and TMV and CMV are the prevalent pathogenic viruses.

Keywords:tobacco viral disease； virus types； Dot-ELISA detection

中图分类号：S435.72

文章编号：1007-5119（2016）02-0006-05

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.02.002

基金项目：国家烟草专卖局项目“全国烟草有害生物调查研究”（NY2010060103007）

作者简介：时洪伟（1989-），男，硕士，研究方向：植物保护。E-mail：honyshi@163.com。*通信作者，E-mail：qling@swu.edu.cn

收稿日期：2015-07-27 修回日期：2015-09-09