长春西汀对糖尿病大鼠静脉桥移植术后再狭窄的影响

张觉宇，蓝志纯，霍天明，李世康



长春西汀对糖尿病大鼠静脉桥移植术后再狭窄的影响

张觉宇，蓝志纯，霍天明，李世康

摘要：目的探讨长春西汀（Vinp）对糖尿病静脉桥移植术后再狭窄的影响及可能作用机制。方法36只SD大鼠随机分为对照组和Vinp组，通过建立糖尿病模型进行自体颈外静脉-颈总动脉移植，分别以生理盐水或者Vinp进行腹腔注射，于术后0周、2周及4周取移植静脉桥制作病理切片，测量内膜厚度，免疫组化法检测增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白表达，通过细胞增殖指数定量描述。Western blot检测核转录因子（NF）-κB的磷酸化水平。结果Vinp干预后明显减少糖尿病血管桥内膜增厚［术后2周：（17.06±5.10）μm vs.（39.79±7.84）μm，P＜0.01；4周：（30.94±5.18）μm vs.（63.67± 18.09）μm，P＜0.01］，同时还降低糖尿病静脉桥PCNA蛋白的表达［术后2周：（21.07±1.38）%vs.（28.13±1.35）%，P＜0.01；4周：（31.73±1.38）%vs.（63.67±18.09）%，P＜0.01］，并抑制NF-κB的磷酸化（术后2周：1.08±0.42 vs.0.84±0.12，P＜0.01）。结论Vinp能有效抑制糖尿病静脉桥术后内膜增厚，其机制可能与抑制NF-κB通路，从而抑制炎症反应有关。

关键词：糖尿病，实验性；移植物闭塞，血管；增殖细胞核抗原；NF-κB；长春西汀；静脉桥；再狭窄

临床实践中，对于存在多支血管病变和糖尿病等危险因素的冠心病患者，冠状动脉旁路移植术（CABG）仍然是重要的治疗方法，然而术后移植静脉较高的再狭窄发生率严重影响手术的远期疗效［1］。静脉桥取材后白细胞相关黏附分子表达升高，促进核转录因子（NF）-κB入核，激活细胞外信号调节激酶（ERK1/2）通路，导致平滑肌细胞异常增殖迁移，这可能与静脉桥再狭窄密切相关［2］，而糖尿病环境中会加重该过程。因此，减轻局部血管的炎性反应，将可能更好地控制移植后静脉桥狭窄的发生。长春西汀（Vinpocetine，Vinp）是从夹竹桃科长春花中提取的一种生物碱，具有抗炎、抗氧化、扩张血管、改善缺血缺氧的作用。最近研究表明，Vinp能够改善糖尿病血管损伤［3］。然而在糖尿病中Vinp是否也可保护血管移植术后血管损伤，尚鲜见报道。本研究通过建立大鼠糖尿病模型进行自体颈外静脉-颈总动脉移植，探讨Vinp对术后移植静脉桥再狭窄的作用效果及其可能机制。

1　材料与方法

1.1材料成年雄性SD大鼠（SPF级）36只，由广西医科大学实验动物中心提供，体质量200～250 g。Vinp和链脲佐菌素（STZ）均购自美国Sigma公司。罗氏血糖仪购自德国罗氏公司。一抗：增殖细胞核抗原（PCNA）兔抗小鼠单克隆抗体IgG，p-NF-κBp65山羊抗小鼠单克隆抗体IgM购自美国圣克鲁斯生物技术公司，GAPDH兔抗小鼠IgG购自中杉金桥公司。二抗：过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔IgG二抗购自上海康成生物工程有限公司。日本Olympus BH-2光学显微镜，双人双目手术显微镜（上海光学仪器厂），显微外科手术器械（宁波手术器械厂），8/0医用无损伤缝合线（宁波医用缝合针厂），Image-Pro Plus Version 6.0计算机图像分析系统。

1.2动物模型建立及分组36只雄性成年SD大鼠腹腔注射STZ55 mg/kg，1周后禁食12 h采血检测空腹血糖，血糖大于16.7 mmol/L为建模成功。采用随机数字表法将大鼠分为Vinp组（Vinp）和对照组（生理盐水），每组18只。糖尿病模型建立成功1周后行自体颈外静脉-颈总动脉移植术，10%水合氯醛按300 mg/kg腹腔注射麻醉，肝素钠（200 U/kg）尾静脉注射肝素化。切开颈部皮肤，游离颈外静脉，8/0线结扎其属支及静脉远、近两端并切取中间段0.8～1 cm，冲洗管腔置肝素钠盐水。充分游离颈总动脉，罂粟碱稀释液喷洒动脉表面，无损伤动脉夹阻断动脉两端血流，切除中间段动脉约0.5 cm，肝素钠盐水冲洗残端。利用“cuff”管套扎术将颈外静脉桥倒转衔接于两残端之间，开放血管夹，碘伏冲洗术野，逐层缝合肌肉、皮下和皮肤。术后当天青霉素40万U/kg肌内注射，常规饲养。

1.3术后处理及标本采集加工术后大鼠按10 mg/（kg·d）剂量分别给予Vinp和生理盐水腹腔注射治疗，常规饲养。剔除感染、死亡大鼠。于移植术后0周、2周及4周切取相当长度的移植静脉。同一样本分成两部分，一部分直接置于4%多聚甲醛固定过夜后，再置于10%中性福尔马林固定，经透明、脱水、石蜡包埋后进行5 μm连续切片，对不同时间点的所有切片进行HE染色及免疫组化检测；另一部分-80℃保存，用于蛋白免疫印迹检测（Western blot）。

1.4组织学观察光学显微镜下观察移植静脉内膜的动态变化并拍照，用Image-Pro Plus 6.0测定内膜厚度。

1.5免疫组化检测血管组织PCNA的表达每根静脉选取3张切片，经过脱蜡，高温高压修复抗原，3%H2O2处理后，山羊血清封闭，PBS洗3次，加一抗4℃过夜后，复温30 min，PBS洗3次，加二抗孵育30 min，滴加DAB显色液显色5 min，经苏木素染色1 min，盐酸乙醇分化后返蓝20 min，镜下观察。每张切片在400倍光镜下观察，在中膜处任意读取5个视野，细胞核内存在棕黄色颗粒为PCNA免疫组化染色阳性细胞，计数每个视野下PCNA阳性细胞数及细胞总数。计算细胞增殖指数（细胞增殖指数=阳性细胞数/细胞总数× 100%），5次计算平均值。

1.6Western blot检测血管组织NF-κBp65蛋白磷酸化情况取-80℃保存的大鼠静脉桥，液氮研磨法碾碎并收集于1.5 mL EP管，立即加入RIPA组织蛋白裂解液及磷酸化酶抑制剂充分裂解30 min，4℃12 000 r/min离心15 min，取上清液，测总浓度后，加入上样缓冲液，沸水浴5 min变性蛋白。制备10%分离胶和4%浓缩胶，加样电泳后将目的蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上，5%BSA封闭液振荡封闭2 h后，一抗（p-NF-κBp65、GAPDH）4℃孵育过夜，洗膜，HRP-IgG二抗室温孵育1 h，洗膜后进行增强化学发光反应，暗室曝光1～3 min，显影定影后冲洗胶片，凝胶成像分析系统（AlphaView Software）分析并计算各目标条带与内参条带灰度值的比值作为目的蛋白磷酸化的相对值。

1.7统计学方法采用SPSS 16.0统计软件进行分析，计量数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1模型一般情况成功建立糖尿病大鼠静脉移植模型36只，无感染及死亡。静脉桥肉眼观充盈良好，将远心端剪断可见鲜红色血流涌出，血流通畅。

2.2Vinp对大鼠静脉桥组织形态的影响0周对照组和Vinp组静脉内膜光滑，无增厚，见图1A、D。术后2周，对照组内膜较Vinp组内膜增厚明显，见图1B、E。术后4周时，对照组内膜亦较Vinp组内膜增厚明显，见图1 C、F，表1。

Tab.1　Comparion of intima thickness between control group and Vinp group表1　对照组与Vinp组内膜厚度的比较　（n=6，μm，x±s）

2.3Vinp对静脉桥组织 PCNA蛋白表达的影响以细胞增殖指数定量描述PCNA蛋白表达，2周和4周对照组较Vinp组细胞增殖指数明显升高，见图2，表2。

2.4Vinp对静脉桥组织NF-κBp65蛋白磷酸化的影响0周时对照组与Vinp组NF-κBp65蛋白磷酸化比较差异无统计学意义，2周时对照组血管中NF-κBp65蛋白磷酸化较Vinp组升高，见图3，表3。

Tab.2　The percentages of PCNA expression in control and Vinp groups表2　对照组和Vinp组PCNA的增殖指数　（n=18，%，x±s）

Fig.3　The phosphorylation of NF-κBp65 in control and Vinp groups图3　对照组和Vinp组NF-κBp65蛋白磷酸化情况

Tab.3　The phosphorylation of NF-κB in control and Vinp groups at two-week表3　2周时对照组和Vinp组NF-κBp65蛋白磷酸化情况　（n=6，x±s）

3　讨论

CABG术后10年内可有近50%移植的静脉桥因发生再狭窄最终导致移植失败［4］；而伴有糖尿病的患者移植失败率更高。糖尿病静脉桥再狭窄可能是一个免疫因素及非免疫因素均参与的病理生理过程。动脉血流快速冲击会造成移植的静脉内皮细胞损伤，暴露内皮下基质，促使血小板与之结合，激活并分泌多种细胞因子、趋化因子和生长因子，进而加速炎症细胞向损伤的内皮黏附、聚集；释放大量炎症介质，进一步造成内皮细胞损伤。糖尿病患者代谢紊乱导致血管内皮细胞长期处于功能失调状态［5］，更加重了术后血管内膜损伤的程度。释放的大量炎性因子、生长因子等还可进一步影响血管平滑肌细胞（VSMCs）的异常增殖、迁移，导致再狭窄的发展［6］。

近年来，对发生再狭窄的静脉桥的宏观及微观层次研究均找到了炎性反应参与静脉桥再狭窄的证据。Bikdeli等［7］通过人体组织病理研究发现，CABG术后静脉桥相比原位大隐静脉具有更高水平的炎性细胞浸润。Tseng等［8］建立小鼠自体血管移植模型进行研究，结果显示移植静脉术后早期有大量白细胞黏附，分泌炎性细胞因子，增强NF-κB及ERK1/2蛋白的磷酸化，促进新生内膜增厚。本研究显示，对照组和Vinp组静脉桥均有不同程度的内膜增厚，且术后2周和4周对照组静脉桥中PCNA蛋白表达及NF-κB的磷酸化明显升高，说明炎性反应和平滑肌细胞的异常增殖迁移参与了静脉桥再狭窄的过程。

此前，Wang等［3］通过建立糖尿病大鼠颈部动脉球囊损伤模型发现，Vinp能抑制NF-κB和ERK1/2蛋白磷酸化，从而减轻血管损伤后新生内膜增厚，但在糖尿病静脉桥方面未做研究。Zhuang等［9］通过Vinp作用于敲除apoE的小鼠实验证明，Vinp亦能抑制AKT/NF-κB通路，从而抑制ERK1/2蛋白磷酸化，减轻动脉粥样硬化。本研究显示，与同期对照组比较，Vinp组新生内膜厚度显著减少，PCNA蛋白表达（细胞增殖指数）明显下降，NF-κBp65磷酸化水平下降，表明该药物可以减轻静脉桥狭窄，其可能机制是通过抑制NF-κB蛋白的活性从而减轻糖尿病静脉桥狭窄。Vinp能改善静脉移植后再狭窄，其有可能成为临床治疗及预防心血管疾病的理想药物。

（图1、2见插页）

参考文献

［1］Harskamp RE，Lopes RD，Baisden CE，et al.Saphenous vein graft failure after coronary artery bypass surgery：pathophysiology，management，and future directions［J］.Ann Surg，2013，257（5）：824-833.

［2］Hinokiyama K，Valen G，Tokuno S，et al.Vein graft harvesting induces inflammation and impairs vessel reactivity［J］.Ann Thorac Surg，2006，82（4）：1458-1464.

［3］Wang K，Wen L，Peng W，et al.Vinpocetine attenuates neointimal hyperplasia in diabetic rat carotid arteries after balloon injury［J］.PLoS One，2014，9（5）：e96894.doi：10.1371/journal.pone.0096894.

［4］Shukla N，Jeremy JY.Pathophysiology of saphenous vein graft failure：a brief overview of interventions［J］.Curr Opin Pharmacol，2012，12（2）：114-120.doi：10.1016/j.coph.2012.01.001.

［5］Radenković M.Pioglitazone and endothelial dysfunction pleiotropic effects and possible therapeutic implications［J］.Sci Pharm，2014，82 （4）：709-721.doi：10.3797/scipharm.1407-16.

［6］Muto A，Model L，Ziegler K，et al.Mechanisms of vein graft adaptation to the arterial circulation：insights into the neointimal algorithm and management strategies［J］.Circ J，2010，74（8）：1501-1512.

［7］Bikdeli B，Hassantash SA，Pourabdollah M，et al.Histopathologic insight into saphenous vein bypass graft disease［J］.Cardiology，2012，123（4）：208-215.doi：10.1159/000343269.

［8］TsengCN，Karlof E，ChangYT，et al.Contribution of endothelial injury and inflammation in early phase to vein graft failure：the causal factors impact on the development of intimal hyperplasia in murine models［J］. PLoS One，2014，9（6）：e98904.doi：10.1371/journal.pone.0098904.

［9］Zhuang J，Peng W，Li H，et al.Inhibitory effects of vinpocetine on the progression of atherosclerosis are mediated by Akt/NF-κB dependent mechanisms in apoE-/-mice［J］.PLoS One，2013，8（12）：e82509.doi：10.1371/journal.pone.0082509.

（2015-08-26收稿2015-10-23修回）

（本文编辑李国琪）

Study on the effect of vinpocetine on the restenosis of venous bypass grafts in diabetic rats

ZHANG Jueyu，LAN Zhichun，HUO Tianming，LI Shikang
Department of Thoracic and Cardiovascular Diseases，First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China Corresponding AuthorE-mail：gxtinghaodi@163.com

Abstract：ObjectiveTo expose the effect and its potential mechanism of vinpocetine（Vinp）on the restenosis of diabetic grafted veins.MethodsThirty-six Sprague-Dawley rats were randomized into saline control group and Vinp treatment group.The autologous jugular vein to carotid artery transplantation was performed in diabetic model rats.Normal saline or Vinp were intraperitoneally injected.The rats were sacrificed at 0，2 or 4 weeks after surgery，then the grafted veins were harvested.The pathological sections were used to detect the effect of Vinp on intimal hyperplasia.The protein expression of proliferating cell nuclear antigen（PCNA）was detected by immunohistochemical method，and which was described by cell proliferation index.The phosphorylation of NF-κB was detected by Western blot assay.ResultsThe treatment of Vinp on intimal hyperplasia in vivo was significant at two weeks after surgery（17.06±5.10）μm versus control group（39.79±7.84 μm，P＜0.01），（30.94±5.18）μm versus（63.67±18.09）μm at four weeks after surgery（P＜0.01）.Vinp treatment effectively reduced the protein expression of PCNA［2 weeks：（21.07±1.38）%vs.（28.13±1.35）%，P＜0.01；4 weeks：（31.73±1.38）%vs. （63.67±18.09）%，P＜0.01］.The treatment of Vinp inhibited phosphorylation of NF-κB at two weeks（1.08±0.42 vs.0.84± 0.12，P＜0.01）.ConclusionVinpocetine can effectively attenuate intimal hyperplasia in diabetic grafted veins，which might be related to its effect on inhibitingphosphorylation of NF-κB as well as inflammation.

Key words：diabetes mellitus，experimental；graft occlusion，vascular；proliferating cell nuclear antigen；NF-kappa B；Vinpocetine；vein graft；restenosis

中图分类号：R654.2

文献标志码：A

DOI：10.11958/20150121

基金项目：广西科学研究与技术开放计划项目（桂科攻1355005-4-8）

作者单位：广西医科大学第一附属医院心胸外科（邮编530021）

作者简介：张觉宇（1990），男，硕士在读，主要从事冠状动脉搭桥术研究

通讯作者E-mail：gxtinghaodi@163.com