RP-HPLC法同时测定芍枣胶囊中3种主要成分的含量

王羽凝，穆丽华，王 石，魏沛沛，王 茹，刘 屏（.解放军总医院外科临床部，北京 008；.解放军总医院临床药理研究室，北京 008；.解放军医学院，北京 008；.蚌埠医学院，安徽 蚌埠 00；.解放军总医院门诊药房，北京 008）



·实验研究·

RP-HPLC法同时测定芍枣胶囊中3种主要成分的含量

王羽凝1，穆丽华2，王 石3，魏沛沛4，王 茹5，刘 屏2（1.解放军总医院外科临床部，北京 100853；2.解放军总医院临床药理研究室，北京 100853；3.解放军医学院，北京 100853；4.蚌埠医学院，安徽 蚌埠 233003；5.解放军总医院门诊药房，北京 100853）

[摘要]目的：建立同时测定芍枣胶囊中3种主要成分的RP-HPLC方法。方法：采用RP-HPLC 法，选用Kromasil C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流动相：乙腈（A）和水（B）；洗脱梯度：0～10 min 10%～19% A，10～16 min 19%～20% A，16～22 min 20%～90% A，22～25 min 90% A，25～25.1 min 90%～10% A，25.1～35 min 10% A；流速：0.8 mL·min-1。Alltech 2000ES ELSD检测器，漂移管温度：115 ℃，空气流速3.3 L·min-1。结果：结果表明芍药苷，斯皮诺素，3,6'-二芥子酰基蔗糖的检测分别在0.975～5.850 μg，0.060～0.660 μg，0.100～0.600 μg范围内线性关系良好。上述3种成分的平均回收率（n = 9）分别为99.5% （RSD 0.69%），100.2%（RSD 1.03%），99.9%（RSD 1.20%）。结论：该方法操作简单、结果准确，具有较好的重复性和稳定性，为芍枣胶囊的质量控制提供理论参考。

[关键词]芍枣胶囊；芍药苷；斯皮诺素；3,6'-二芥子酰基蔗糖；反相高效液相色谱法

1　仪器与试药

Hitachi高效液相色谱仪（日本日立公司），Alltech 2000ES蒸发光散射检测器（美国奥泰公司）、梅特勒-托利多AG285型电子天平（瑞士梅特勒公司），KQ-250E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。芍药苷对照品（纯度：98%，批号110736-201539），斯皮诺素对照品（纯度：98%，批号111869-201203）均购自中国食品药品检定研究院；3,6'-二芥子酰基蔗糖对照品（解放军总医院药理室自制，纯度> 98%）。芍枣胶囊（解放军总医院自制，规格：0.34 g）。乙腈为色谱纯，水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1溶液的配制

2.1.1对照品溶液 分别精密称取芍药苷、斯皮诺素、3,6'-二芥子酰基蔗糖对照品适量，分别甲醇溶解，配制成芍药苷0.195 g ·L-1、斯皮诺素0.030 g·L-1、3,6'-二芥子酰基蔗糖0.050 g·L-1，各标准品取适量体积混合作为混合对照品,混合后芍药苷的浓度为0.039 g·L-1，斯皮诺素0.012 g ·L-1，3,6'-二芥子酰基蔗糖0.020 g·L-1。

2.1.2供试品溶液 精密称定本品内容物0.300 0 g，加入70%乙醇适量，加热回流2 h，滤过，滤渣甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液经0.45 μm滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.1.3阴性对照溶液 按处方中药味的比例，分别称取除白芍、酸枣仁、远志外的其他药材，按照芍枣胶囊的制备工艺和供试品溶液的制备方法分别制备白芍、酸枣仁、远志的阴性对照溶液。

2.2色谱条件

Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）和水（B）；洗脱梯度：0～10 min 10%～19% A，10～16 min 19%～20% A，16～22 min 20%～90% A，22～25 min 90% A，25～25.1 min 90%～10% A，25.1～35 min 10% A；流速：0.8 mL ·min-1。Alltech 2000ES ELSD检测器，漂移管温度：115 ℃；空气流速：3.3 L·min-1；进样量：10 μL。

按照上述色谱条件进行测定，结果显示芍药苷，斯皮诺素，3,6'-二芥子酰基蔗糖的色谱峰得到很好的分离，阴性对照品对样品测定无干扰，待测组分与相邻组分均达到基线分离，各成分理论塔板数不低于3000，分离度良好，详见图1。

图1　HPLC 色谱图A–芍枣胶囊供试品，B–对照品，C–白芍阴性对照，D–酸枣仁阴性对照，E–远志阴性对照；1–芍药苷，2–斯皮诺素，3–3,6'-二芥子酰基蔗糖Fig 1 HPLC ChromatogramsA–sample, B–reference substance, C–Baishao negative control, D–Suanzaoren negative control, E–Yuanzhi negative control; 1–paeoniforin，2 - spinosin，3 - 3，6'-disinapoyl sucrose

2.3线性关系考察

按“2.2”项下色谱条件，分别精密吸取芍药苷对照品溶液5、10、15、20、25、30 μL，斯皮诺素对照品溶液2、6、10、14、18、22 μL，3,6'-二芥子酰基蔗糖对照品溶液2、4、6、8、10、12 μL注入高效液相色谱仪，测定峰面积。以进样量的常对数为横坐标（X），以峰面积的常对数为纵坐标（Y），计算芍药苷、斯皮诺素和3,6'-二芥子酰基蔗糖的回归方程分别为Y = 0.996 X + 5.435，r = 0.999 9；Y = 1.009 X + 4.305，r = 0.999 9；Y = 1.007 X + 4.824，r = 0.998 9。结果表明，芍药苷，斯皮诺素，3,6'-二芥子酰基蔗糖分别在0.975～5.850 μg，0.060～0.660 μg，0.100～0.600 μg范围内线性关系良好。

2.4精密度实验

精密吸取同一浓度的对照品溶液10 μL，按“2.2”项下色谱条件，重复进样6次，记录峰面积。结果显示，芍药苷、斯皮诺素、3,6'-二芥子酰基蔗糖峰面积的RSD分别为0.71%、0.94%、0.86%，表明仪器精密度良好。

2.5稳定性实验

按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件，分别在0、2、8、12、24 h进样10 μL，记录峰面积。结果显示，芍药苷、斯皮诺素、3,6'-二芥子酰基蔗糖峰面积的RSD分别为0.92%、1.21%、1.63%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6重复性实验

精密称取芍枣胶囊6份，按“2.1.2”项下制备供试品溶液6份，分别按“2.2”项下色谱条件，分别进样10 μL，记录峰面积并计算含量。结果显示，芍药苷、斯皮诺素和3,6'-二芥子酰基蔗糖平均含量分别为23.602、0.880、0.621 mg·g-1，RSD分别为1.32%、0.91%、1.26%，表明该方法重复性良好。

2.7加样回收率实验

精密称取9份已知含量的同一批芍枣胶囊，分别加入适量芍药苷、斯皮诺素和3,6'-二芥子酰基蔗糖对照品溶液，按“2.1.2”项下制备供试液，进样10 μL，记录峰面积，计算各对照品的加样回收率。结果表明，芍药苷、斯皮诺素、3,6'-二芥子酰基蔗糖的平均回收率分别为99.5%、100.2%、99.9%，RSD分别为0.69%、1.03%、1.20%。详见表1。

2.8样品含量测定

按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别对4批次芍枣胶囊中芍药苷、斯皮诺素、3,6'-二芥子酰基蔗糖的含量进行分析，记录色谱峰面积，根据回归方程计算各组分含量，详见表2。

3　讨论

3.1色谱条件选择

芍枣胶囊中的芍药苷、斯皮诺素、3,6'-二芥子酰基蔗糖的最大紫外吸收波长差别较大，使二极管阵列检测器很难同时测定3种主要成分，而蒸发光散射检测器为质量型检测器，流动相在检测前即已蒸发，因此提高了其基线的稳定性和检测的准确性。本课题组曾尝试采等度洗脱，但分离效果不够理想，在筛选了多个梯度流动相之后，最终选定乙腈（A）和水（B）作为流动组，洗脱梯度：0～10 min 10%～19% A；10～16 min 19%～20% A；16～22 min 20%～90% A；22～25 min 90% A；25～25.1 min 90%～10% A；25.1～35 min 10% A。在此色谱条件下，色谱图结果显示基线平稳，杂质峰少，分离度良好。雾化气体流速和漂移管温度是蒸发光散射检测器的两个重要可调节参数。实验中经过反复、仔细调节参数，得到了最优信噪比及平稳基线。

表1　芍枣胶囊加样回收率实验结果. n = 9Tab 1 Results of recovery test of Shaozao capsules. n = 9

表2　芍枣胶囊样品含量测定结果. mg·g-1Tab 2 Content determination of Shaozao capsules sample. mg·g-1

3.2提取方法考察

提取方法的选择对比了超声和回流提取方法，结果显示加热回流提取法的效果更佳，并且耗时短、操作方便。溶媒的选择考察了甲醇、95%乙醇、70%乙醇、水，结果显示70%乙醇提取效果最好。随后考察了溶剂量（1∶10，1∶50，1∶100）和提取次数，结果表明，50倍量的70%乙醇，加热回流提取2 h，可提取完全。

3.3结果分析

含量测定结果表明，不同批次之间相同指标成分含量差异不明显，表明提取工艺稳定、可靠。本研究建立了同时测定芍枣胶囊中芍药苷、斯皮诺素、3,6'-二芥子酰基蔗糖的反相高效液相色谱测定方法，为芍枣胶囊的质量控制提供了理论参考。

[参考文献]

[1] 钟海平，张光霁.失眠的病因与发病机制[J].浙江中医药大学学报，2009，33（3）：307-308.

[2] 陈德瑶，何思陈，周道友.中药治疗失眠的系统评价[J].中华中医药学刊，2016，34（1）：105-110.

[3] 张岗强，周小江，刘明月，等.肝胆两益汤镇静促眠作研究[J].中国药理学与毒理学杂志，2012，26（3）：446.

[4] 王燕，张岗强，张楠，等.肝胆两益汤对失眠模型大鼠不同脑区中单胺类神经递质的影响[J].中国药物应与监测，2015，12（4）：215-219.

[5] 李娉婷，陈子娇，贾薇，等.中药胶囊剂中芍药苷含量测定方法优化[J].时珍国医国药，2014，25（10）：2357-2359.

[6] 王道东.龙芍续骨胶囊中芍药苷含量测定[J].辽宁中医药大学学报，2015，17（10）：51-53.

[7] 宋佳，段树卿，黄飞龙，等.心神宁片中酸枣仁成分的质量控制研究[J].中国当代医药，2015，22（33）：12-16.

[8] 戴莹，姜艳艳，陈小虎，等.基于类药成分3,6'-二芥子酰基蔗糖和α-细辛醚的开心散质量控制方法研究[J].北京中医药大学学报，2011，34（4）：254-257.

Determination of three main constituents in Shaozao capsules by RP-HPLC

WANG Yu-ning1, MU Li-hua2, WANG Shi3, WEI Pei-pei4, WANG Ru5, LIU Ping2(1. Clinical Surgery Division, PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 2. Department of Clinical Pharmacology, PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 3. Medical School of Chinese PLA, Beijing 100853, China; 4. Faculty of Pharmacy, Bengbu Medical College, Bengbu 233003, China; 5. Outpatient Pharmacy, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

[ABSTRACT]Objective: To establish the quantitative method of three main constituents in Shaozao capsules by RPHPLC method. Methods: The separation was performed on Kromasil C18column （4.6 mm × 250 mm，5 μm） by RP-HPLC method. The mobile phase consisted of acetonitrile (A) and water (B), elution gradient was as follows: 0–10 min 10%–19% A; 10–16 min 19%–20% A; 16–22 min 20%–90% A; 22–25 min 90% A; 25–25.1 min 90%–10% A; 25.1–35 min 10% A. The flow rate was 0.8 mL ·min-1. The detector was Alltech 2000ES ELSD. The temperature of drift tube was 115 ℃ and the air flow rate was 3.3 L·min-1. Results: The linear ranges of the three components were 0.975–5.850 μg (paeoniflorin), 0.060–0.660 μg （spinosin） and 0.100–0.600 μg （3，6'-disinapoyl sucrose) respectively. The average recoveries of the above three components in Shaozao capsules were 99.5% (RSD 0.69%), 100.2% (RSD 1.03%), 99.9% (RSD 1.20%) respectively. Conclusion: The method was reliable, simple, and precise, which was suitable for quality control of Shaozao capsules.

[KEY WORDS]Shaozao capsules；Paeoniforin；Spinosin；3，6'-disinapoyl sucrose; RP-HPLC

[中图分类号]R917

[文献标识码]A

[文章编号]1672–8157(2016)02–0077–04

[基金项目]军队“十二五”中医药推广研发项目（10ZYZ141）

[通信作者]刘屏，女，研究员，主要从事中药化学和中药药理研究。E-mail：liuping301@126.com

[作者简介]王羽凝，女，主管药师，主要从事中药药理和中药化学研究。E-mail：sunny_5087@163.com

收稿日期：（2015-11-21 修回日期：2016-01-12）