纺织品中双酚A的表面等离子体共振辅助检测方法

臧佳鑫， 刘 芳， 魏孟媛， 薛文良,， 钟成宗

(1. 东华大学 纺织面料技术教育部重点实验室， 上海 201620； 2. 上海出入境检验检疫局，上海 200120； 3. 佛山市南海南方技术创新中心有限公司， 广东 佛山 528000)

纺织品中双酚A的表面等离子体共振辅助检测方法

臧佳鑫1， 刘 芳2， 魏孟媛2， 薛文良1,3， 钟成宗3

(1. 东华大学 纺织面料技术教育部重点实验室， 上海 201620； 2. 上海出入境检验检疫局，上海 200120； 3. 佛山市南海南方技术创新中心有限公司， 广东 佛山 528000)

鉴于双酚A(BPA)能够干扰生物的内分泌功能，引起各种生殖异常，威胁着婴幼儿的健康，甚至有致癌的危险等生物危害性，采用表面等离子体共振技术(SPR)对BPA进行定性定量检测。从传感芯片的修饰、BPA-BSA溶液最佳质量浓度的确定、不同质量浓度BPA的响应情况以及纺织品中BPA的萃取等4个方面出发，探索了SPR技术检测纺织品中BPA的实用性。结果表明，BPA的SPR检测法具有检测速度快、对样品要求低、检测针对性强、检测灵敏度高等优点，适合检测领域的广泛应用，可应用于纺织品中双酚A含量的测定。

表面等离子体共振；全反射；生物传感器；双酚A；纺织品检测

在经济全球化各国间贸易往来频繁的大环境下，进出口消费品的检测备受关注，在传统检测技术基础上，新兴检测技术也在蓬勃发展，表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)技术作为新兴检测技术之一，过去的二十几年中，在医药方面有了长足的发展。在其他检测领域，SPR技术也在不断突破，在与其他检测技术联用方面也取得了一定的成效。

SPR技术起源于1902年，Wood首次观测到连续光谱的偏振光照射金属光栅时出现的衍射现象，即SPR现象[1]。1941年，Fano解释了SPR现象。1968年，Otto首先设计了Otto型棱镜SPR传感系统；1971年，Krestchmann对Otto型SPR传感系统进行了改进[1]。1983年，Liedberg首次采用SPR技术测试抗原抗体的相互作用[2]。1990年，瑞典Biacore公司生产出世界上第一台SPR仪[3]，开创了SPR技术在检测领域的新篇章。

双酚A(BPA)是生产聚碳酸酯塑料和环氧树脂的重要原料，也可用于生产各种纺织品染整助剂，如增塑剂、阻燃剂、抗氧化剂等[4]。在纺织生产中，BPA最典型的应用是变色功能纺织品上的热敏变色印花的显色剂[5]，但是BPA被认定是一种环境激素，能够干扰多种生物的内分泌功能，导致生殖功能下降，引起各种生殖异常，还能使免疫力降低[6]；同时，BPA还具有一定的胚胎毒性和致畸性，威胁胎儿和儿童的健康，有致癌的危险[5]。癌症和新陈代谢紊乱所导致的肥胖也被认为与BPA有关。欧盟认为含双酚A奶瓶会诱发性早熟，从2011年3月2日起，禁止生产含BPA的婴儿奶瓶。本文以双酚A(BPA)为检测对象，采用表面等离子体共振技术，探索纺织品中BPA的SPR检测方法。

1 SPR方法的工作原理

表面等离子体共振是一种物理化学现象。当一束光线从折射率高的介质射入折射率低的介质时，若入射角大于临界角(折射角达到90°时的入射角)，入射光线形成全反射现象[7]。当偏振光在玻璃和金属薄膜的界面上发生全内反射时，会产生渐逝波，从而引发金属薄膜中的自由电子产生表面等离子体，在入射角达到某一特定值时，这些表面等离子体就会与渐逝波发生共振[8]，即SPR现象。

SPR分析仪利用SPR现象，通过在金膜表面修饰与目标物能够特异性结合的物质，当目标物流过金膜表面时，形成特异性吸附[9]，而使反射光光谱产生变化，用光学信号的变化反映分子质量的变化，从而实现传感检测。基于这种原理研究纺织品中危害因子SPR法检测的可行性。由于纺织品中有毒有害残留大都是一些小分子物质，将对目标危害因子有特异性吸附作用的配体(识别因子)固定在芯片表面，当目标危害因子和识别因子特异性吸附时，引起折射率变化[10]，实现定性定量检测。

SPR分析仪的核心部件是芯片，由金属薄膜和玻璃片复合而成。金属薄膜最常采用的材料是纯金[11]。基于金的化学惰性较强，在修饰芯片时，要选用一定的方法将配体修饰在金膜表面。

SPR检测分析方法分为直接法和间接法。直接法是指将抗体修饰在金膜表面，通过目标物与抗体结合引发共振信号的改变来达到检测目的。这种方法操作简单，但仅适用于大分子的检测，检出限也比较高。间接法的核心在于提高信号强度，用于小分子的浓度测定或动力学研究。目前最常用的间接分析方法有信号增强法、竞争结合法和竞争抑制法。

2 试验样品准备

2.1 仪 器

SPR-Navi表面等离子体共振仪(温度控制在比室温略低1～2 ℃)；传感芯片：裸金芯片，羧甲基葡聚糖组装(CMD)芯片；超声波发生器：工作频率为40 kHz；立式高压灭菌器(110 ℃)。

2.2 溶液配方

2.2.1 芯片修饰溶液

11-巯基十一烷酸(11-MUA)的乙醇溶液：将0.109 g的11-MUA溶于100 mL的无水乙醇中制得。

2-吗啉乙磺酸溶液：将1.95 g 2-吗啉乙磺酸(MES)溶于100 mL灭菌水中，用氢氧化钠(NaOH)溶液调节pH值至5.0。

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐溶液：将0.077 5 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐(EDC)溶于1 mL的MES溶液制得。

N-羟基琥珀酰亚胺溶液：将0.021 7 g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于1 mL的MES溶液制得。

三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液： 将0.605 5 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶于100 mL灭菌水，用盐酸(HCl)溶液调节pH至6.0。

双酚A 单克隆抗体(BPA-6C6)溶液：用Tris-HCl溶液将其稀释至2×10-4μg/mL。

乙醇胺盐酸盐溶液：将0.975 4 g乙醇胺盐酸盐溶于10 mL灭菌水，用NaOH 溶液调节pH值至8.5。

2.2.2 测试溶液

磷酸盐(PBS)缓冲溶液：将8 g 氯化钠(NaCl)、1.44 g磷酸氢二钠(Na2HPO4)、0.2 g氯化钾(KCl)和0.24 g磷酸二氢钾(KH2PO4)溶于800 mL纯水中，用HCl 溶液调节pH值至7.4，再定容至1 L。

双酚A-牛血清白蛋白(BPA-BSA)溶液：由于不同批次购买的BPA-BSA溶液浓度不一，先用PBS溶液将BPA-BSA溶液稀释至1×10-4μg/mL备用，根据试验要求的质量浓度用PBS溶液进行稀释。

甘氨酸-盐酸溶液：50 mL 0.2 mol/L的甘氨酸溶液与40 mL 0.2 mol/L的HCl溶液混合，加灭菌水稀释至200 mL，用HCl 溶液调节pH值至2.2。

BPA溶液：1 mg BPA溶于10 mL PBS溶液，配成1×10-4μg/mL备用。根据试验要求的质量浓度用PBS溶液进行稀释，并与相应质量浓度BPA-BSA溶液混合。

3 试验方案

3.1.1 裸金片修饰方法

1)取一片全新裸金片，用1 mmol/L的11-巯基十一烷酸(MUA)浸没，4 ℃浸泡过夜；2)将浸泡过夜的芯片用灭菌水清洗，用N2吹干；3)在芯片表面先滴加150 μL的EDC溶液，再滴加150 μL的NHS溶液，于室温下静置1 h；4)将芯片水洗吹干，在表面滴加200 μL的BPS-6C6溶液，置于37 ℃恒温箱中3 h；5)将芯片水洗吹干，在芯片表面滴加200 μL 1 mol/L 的乙醇胺盐酸盐溶液，室温静置1 h；6)将芯片洗净吹干备用，或放置于PBS溶液中，4 ℃贮存。

3.1.2 CMD芯片修饰方法

由于CMD芯片表面已经修饰上羧甲基葡聚糖，存在Au-S键，因此，在芯片修饰时，仅需进行3.1.1中的2)～6)步，且方法相同。

3.2 测试方法

3.2.1 不同质量浓度的BPA-BSA溶液测试曲线

“一带一路”建设中的广西保险业创新路径 ………………………………………………………………… 吴望春 李春华（5/44）

将修饰过的芯片放入SPR仪，调节仪器温度使之低于室温1～2 ℃，调节流速为30 μL/min，待曲线稳定后开始试验。试验的缓冲溶液为PBS溶液，再生溶液为pH=2.2的甘氨酸-盐酸溶液。试验中，进样均为注射进样，具体步骤如下。

1)通入PBS缓冲溶液，待基线趋于稳定。

2)进某一质量浓度的BPA-BSA溶液，反应 6 min左右。

3)进PBS缓冲溶液清洗芯片约8 min。

4)进再生溶液，再生时间应控制在6 min内，以免破坏芯片的修饰层。

5)进PBS缓冲溶液，洗去再生溶液。

图1示出质量浓度为3×10-4μg/mL的BPA-BSA溶液的响应曲线。该质量浓度下所对应的响应值(RU值)变化量为②段与①段的RU值之差；不同质量浓度的BPA-BSA溶液的响应曲线走势基本一致，而响应强度不同。

图1 质量浓度为3×10-4 μg/mL的 BPA-BSA溶液的响应曲线Fig.1 Response curve of 3×10-4 μg/mL BPA-BSA

3.2.2 最优的BPA-BSA溶液质量浓度

由于芯片对于不同质量浓度的BPA-BSA溶液的响应有极限值，当质量浓度足够大时，RU值变化量几乎不再随质量浓度的增加而增大，因此，找到质量浓度的临界值是探索方法的关键，临界质量浓度不仅可保证芯片对BPA-BSA的响应达到最明显，也可有效节约成本。此临界质量浓度即为最优BPA-BSA溶液质量浓度。

采用Fixed Angle模式，在固定角条件下进行试验，步骤如3.2.1中所介绍，BPA-BSA溶液的质量浓度范围设定为0～7×10-5μg/mL。图2示出不同质量浓度BPA-BSA溶液所对应RU值变化量曲线。

图2 不同质量浓度的BPA-BSA溶液所对应的RU值变化量Fig.2 RU value change of BPA-BSA with different concentrations

由图2可知：当BPA-BSA溶液质量浓度低于2×10-5μg/mL时，随质量浓度的升高，RU值变化量的增大比较缓慢；当BPA-BSA溶液质量浓度在2×10-5～4×10-5μg/mL时，RU值变化量随质量浓度的升高而迅速增大，有明显的增长，增幅近倍；而当BPA-BSA溶液质量浓度高于4×10-5μg/mL时，尽管质量浓度不断升高，但RU值变化量几乎不变，保持在一个非常稳定的范围内。由此可见，BPA-BSA溶液的最优质量浓度可确定为4×10-5μg/mL。

3.2.3 不同质量浓度的BPA溶液响应测试

采用Angular Scan模式，在角范围条件下进行试验，此模式下的RU值响应要高于Fixed Angle模式，而RU值的变化量也相应高于Fixed Angle模式，利于比较芯片对质量浓度接近的BPA溶液的响应情况。

在BPA-BSA溶液的最优质量浓度进行试验，样品为4×10-5μg/mL的BPA-BSA与x×10-6μg/mL的BPA混合溶液(x=5n，n∈[0，9])，缓冲溶液为PBS溶液，再生溶液为pH=2.2的甘氨酸-盐酸溶液。

将修饰过的芯片放入SPR仪，调节仪器温度使之低于室温1～2 ℃，调节流速为30 μL/min，待曲线稳定后开始试验。试验中，进样均为注射进样，具体步骤如下。

1)通入PBS缓冲溶液，待基线趋于稳定。

2)进4×10-5μg/mL的BPA-BSA与x×10-6μg/mL的BPA混合溶液，反应6 min左右。

3)进PBS缓冲溶液清洗芯片约8 min。

4)进再生溶液，再生时间应控制在6 min内。

5)进PBS缓冲溶液，洗去再生溶液。

图3示出不同质量浓度BPA与4×10-5μg/mL BPA-BSA混合溶液所对应RU值变化量。

图3 不同质量浓度的BPA与4×10-5 μg/mL BPA-BSA的 混合溶液所对应的RU值变化量Fig.3 Change of RU value of 4×10-5 μg/mL BPA-BSA and BPA with different concentrations

由图3可知，在BPA-BSA溶液质量浓度为4×10-5μg/mL(处于最优溶浓度)条件下，刚开始形成4×10-5μg/mL BPA-BSA + 5×10-6μg/mL BPA混合液时，RU值变化量有明显下降。当BPA质量浓度在5～3×10-5μg/mL范围内时，RU值变化量与BPA质量浓度之间的线性关系良好，稳步下降；RU值变化量与BPA质量浓度的线性方程为y=-27.06x+922.67，相关系数R2=0.995 9。而BPA质量浓度在3.5×10-5～4.5×10-5μg/mL时，由于接近BPA-BSA质量浓度，RU值变化量很低，已接近0。

对于线性情况良好的5×10-6～3×10-5μg/mL段，这一质量浓度范围内所对应的RU值变化量符合方程y=-27.06x+922.67，其中x代表质量浓度，y代表RU值变化量。定量准确，可用于测定纺织品中的BPA的定量检测，检出限为1×10-6μg/mL。

表1示出双酚A的加标回收率。根据表1可知，在5×10-6～3×10-5μg/mL范围内时，双酚A的平均加标回收率约92%～104%，重现性良好。

表1 双酚A的加标回收率Tab.1 Recovery of bisphenol A

4 与传统检测方法的比较

目前，双酚A的检测还处于新兴阶段，应用较多的检测方法还是比较传统的液相、气相检测法。主要有高效液相色谱法[12]、高效液相色谱-质谱法[13]、气相色谱质谱法[14]、衍生化气相色谱质谱法[15]、荧光法[16]等。参考精度较高的气相色谱质谱法，该方法检出限为1×10-6μg/mL，定量限为4×10-6μg/mL。样品平均回收率在90%～120%[14]。相比之下，SPR检测法的检出限也为1×10-6μg/mL，但回收率范围更精准，精度和准确度较气相色谱质谱法更优。

5 纺织品检测中的实用性

BPA作为纺织品的助剂(增塑剂、阻燃剂等)，应用于纺织面料、服装的生产过程中，BPA溶于甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、醚、苯、醋酸和碱性溶液，微溶于四氯化碳，难溶于水。将BPA的SPR检测法有效应用于纺织品检测中，必须要解决的问题是如何将纺织品中的BPA尽可能地完全分离出来。考虑到丙酮、醚、苯等的挥发性、生物毒性等因素，确定用醇作为萃取液，其中，甲醇和乙醇的萃取效果较好。

以选用甲醇作为萃取液为例，萃取方法如下：1)称取1.0 g待测样品，剪碎，置于反应器中；2)加入10 mL甲醇，确保样品完全浸没在甲醇中，超声萃取30 min；3)将萃取液用聚四氟乙烯微孔滤膜过滤器过滤，经水浴氮吹仪浓缩，定容至1 mL，备用；4)采用SPR检测法检测BPA的含量，选用甲醇或乙醇对纺织品中的BPA进行萃取，可有效地将BPA分离出来，操作简单快捷，且试验成本较低，可应用于大批量的纺织品中BPA的检测。

6 结 论

本文建立了测定纺织品中BPA的SPR检测法，该方法检出限为1×10-6μg/mL，样品的平均加标回收率约为92%～104%，在5×10-6～3×10-5μg/mL范围内线性关系良好，相关系数R2=0.995 9。该方法具有检测速度快(检测时间至少可缩短一半以上)，对样品要求低，可在浑浊样品中进行检测，特异性识别度高，一台仪器便可完成对无机类危害因子和有机类危害因子的检测等传统纺织品检测方法所不能匹敌的优点；同时，制样简便快捷，适合检测领域的广泛应用，可应用于纺织品中双酚A含量的测定。

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Detection methods of bisphenol A in textile based on surface plasmon resonance

ZANG Jiaxin1， LIU Fang2， WEI Mengyuan2， XUE Wenliang1,3， ZHONG Chengzong3

(1.KeyLaboratoryofTexileScience&Technology,MinistryofEducation,DonghuaUniversity,Shanghai201620,China； 2.ShanghaiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Shanghai200120,China； 3.FoshanNanhaiSouthernTechnologyInnovationCenterCo.,Ltd.,Foshan,Guangdong528000,China)

Since Bisphenol A (BPA) can interfere with the endocrine function of the organism, causing all kinds of reproductive abnormalities. At the same time, BPA also has a certain embryonic toxicity and produce teratogenetic and carcinogenic effects, threatening the health of the fetus. It is necessary to test BPA in textiles. BPA is used as the dyeing and finishing auxiliaries in the textiles, and has certain harm to the health of textile users. In the light of the biological hazards of BPA in textiles, it adopts surface plasmon resonance (SPR) to perform the qualitative and quantitative detection of BPA. The practicability of SPR technology in the detection of BPA was explored from four aspects, such as chip modification, determination of the optimum concentration of BPA-BSA solution, the response of BPA with different concentrations and the extraction of BPA in textiles. SPR detection method of BPA has advantages of high detection speed, strong pertinence and high detection sensitivity and low requirements on the sample, is applicable in the detection field, and can be used in the determination of the biphenol A content in textiles.

surface plasmon resonance; total reflection; biological sensor; bisphenol A; textile testing

10.13475/j.fzxb.20150602306

2015-06-10

2015-11-16

国家质检总局科技计划项目(2015IK239)

臧佳鑫(1991—)，女，硕士生。主要研究方向为纺织材料与纺织品设计。薛文良，通信作者，E-mail:xwl@dhu.edu.cn。

TS 157

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