微波消解ICP-MS法测定中华白海豚额隆中微量元素及其含量特征分析

张灵莉，丁玉龙，张 美，桂 端，宁 曦，李 俊，吴玉萍*

1. 南海资源开发与保护协同创新中心，广东 广州 510275

2. 中山大学生命科学大学院，广东 广州 510275

3. 中山大学海洋学院，广东 珠海 519082

微波消解ICP-MS法测定中华白海豚额隆中微量元素及其含量特征分析

张灵莉1, 2，丁玉龙1, 3，张 美1, 3，桂 端1, 3，宁 曦2, 3，李 俊1, 3，吴玉萍1, 3*

1. 南海资源开发与保护协同创新中心，广东 广州 510275

2. 中山大学生命科学大学院，广东 广州 510275

3. 中山大学海洋学院，广东 珠海 519082

中华白海豚是我国一级保护动物，处于海洋食物链顶端，而重金属、持久性有机污染物等污染物易在其体内富集。额隆是鲸豚回声定位的重要部位，具有传导信号的作用。为探究中华白海豚额隆中微量元素的基线水平以及其组成的主要特征成分，研究采用微波消解电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法测定了中华白海豚额隆中V，Ni，Cr，Mn，Cu，As，Zn，Hg，Se，Cd和Pb 11种微量元素并对其含量进行特征分析。结果表明该方法具有良好的准确度和精密度，适合于中华白海豚额隆微量元素的测定分析。样品分析显示，额隆中11种微量元素整体含量水平不高，由于个体生理状况不同，同种元素含量在不同个体中存在差异；其平均含量从高到低排序依次为：Zn>As>Cu>Mn>Se>Hg>Cr>Ni>Pb>V>Cd，其中As作为非必需有毒微量元素，含量水平较高(1.158 μg·g-1ww)，可能会对海豚产生生理毒害作用。Spearman相关性分析显示，As(r=0.733)，Cd(r=0.615)和Hg(r=0.645)含量与海豚体长呈显著正相关性(p<0.05)，表明As，Cd和Hg三种元素可随海豚年龄增加而在额隆中富集；Cs与Ni呈正相关(p<0.05)，Mn与As呈负相关(p<0.01)，表明元素间也存在着一定的关联性。此外，主成分分析结果表明，V，Mn，Ni，Se，Cu和Hg为中华白海豚额隆主要特征微量元素。研究在国内首次使用微波消解ICP-MS法对中华白海豚额隆中微量元素进行研究，结合相关性分析和主成分分析，有效探究了中华白海豚额隆中微量元素的生物富集模式与含量特征，实验结果为研究中华白海豚额隆中微量元素基线水平提供了参考。

中华白海豚；额隆；电感耦合等离子质谱；微量元素；微波消解

引 言

中华白海豚(Sousachinensis)，即印度太平洋驼背豚，是中国海洋鲸豚类唯一的国家一级野生保护动物。珠江口是我国中华白海豚最主要的栖息地，然而随着沿岸城市经济的高速发展，使该水域污染问题日渐严重[1]。在鲸豚组织中，微量元素易富集，难降解，存在生物积累及放大现象，因此鲸豚被认为是海洋环境理想的指示物种[2-3]。额隆作为海豚声呐系统的重要部件，在声发射过程中起着声透镜的作用，这种特殊生理机能与其所含饱含的脂肪酸组成密切相关[4]。而迄今尚未有关于中华白海豚额隆中微量元素的相关研究。

目前，测定油脂中微量元素的前处理技术主要有干法灰化，湿法消解，微波消解等方法，微波消解法具有耗时短，空白低，耗酸少，精密度好，准确度高等优点[5]，是处理中华白海豚额隆样品的首选方法。油脂中微量元素含量测定的传统方法主要电化学分析法，离子色谱法，原子荧光光谱法，原子吸收法，电感耦合等离子体原子发射光谱法等，但这些方法存在分析检测限高，周期较长，操作繁琐等缺点。目前，电感耦合等离子体质谱法是发展最快的痕量元素分析技术之一，具有检出限低，线性动态范围广，干扰少，分析精密度高等特点，已广泛应用于鲸豚肌肉，肝脏和肾脏组织中微量元素的测定[6-7]。本文首次建立了微波消解ICP-MS法测定了中华白海豚额隆中V，Ni，Cr，Mn，Cu，As，Zn，Hg，Se，Cd和Pb共11种微量元素，该方法能快速，简捷，准确的测定海豚额隆中微量元素，为了解中华白海豚健康情况以及研究其元素特征模式提供了科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器

Agilent 7700X电感耦合等离子体质谱仪(Agilent Technologies, USA)；XT-9912型密闭式智能微波消解/萃取仪(Xintuo, Shanghai)；CascadaTM超纯水机(Pall, USA)；AB104-N分析天平(METTLER TOLEDO，精度0.1 mg)。

1.2 试剂与材料

硝酸(优级纯，美国Sigma)；双氧水(优级纯，广州化学试剂厂)；国际标准物质龙虾肝胰脏(TORT-2, NRCC, Canada)；美国加联多元素标液(Agilent Technologies, USA)；元素标准储备液(SPEX CertiPrep, Inc.，USA)；Ge，Sc，Bi和In内标液(Agilent Technologies, USA)。

本研究选取2007年—2014年在珠江口水域搁浅死亡的11头中华白海豚作为研究对象。搁浅的中华白海豚经专业人员测量记录体长，体重及各形态学参数后，按照标准化的解剖流程进行解剖。研究所用的额隆样品用锡箔纸包裹，避光-20 ℃保存。

1.3 仪器参数

本研究样品采用微波消解法进行消解，具体参数见表1。

表1 微波消解步骤参数

质谱仪工作状态和操作参数对仪器的灵敏度，精密度等一些重要的分析性能有较大影响。本文应用单变量法对高分辨等离子体源的各项参数进行优化，优化后的ICP-MS工作参数满足仪器安装标准要求的稳定性，背景，双电荷，氧化物和灵敏度等各项指标。具体参数见表2。

1.4 样品制备

实验前，所使用仪器设备都经过双氧水浸泡擦拭，使用的实验器皿均在20%硝酸中浸泡过夜，并用超纯水(电阻率≥18.2 MΩ·cm)冲洗。

额隆样品按照以下方法进行预处理：样品解冻后准确称取0.2 g(精确至0.000 1 g)，置于酸煮洗净的聚四氟乙烯消解罐中，加入6 mL 优级纯硝酸和2 mL超纯水预消解12 h。然后按照设定好的消解程序进行微波消解(见表1)；期间进行第二次消解前，加入2 mL 30%优级纯双氧水。待消解完毕后，冷却至室温。使用50 mL注射器配合微孔滤膜进行消解液过滤，用少量超纯水洗涤消解罐内壁，内盖以及注射器内壁3～4次，洗涤液并入50 mL聚丙烯管中，并用超纯水定容至50 mL。前处理液在上机前摇匀放置于4 ℃冰箱中保存。每次样品操作时，都在相同条件下随同试样进行空白试验。

表2 ICP-MS仪器参数

1.5 数据处理

采用Excel 2013进行统计数据；运用SPSS 20.0统计软件对中华白海豚额隆微量元素进行spearman元素相关性分析和主成分分析，主成分提取选取特征值大于1的前m个主成分。元素含量均以湿重μg·g-1计。

2 结果与讨论

2.1 消解条件优化

有研究运用电感耦合等离子发射光谱法考察5种消解方法对植物油样品多元素测定结果的影响，结果表明，微波消解法相对于其他四种样品处理方法具有精密度和准确度高，耗时短，消耗溶剂少，空白位低等优势，是最佳的消解方法。因此，本文选择微波消解法处理样品。

在微波消解反应中，硝酸是常用的一种强氧化剂，可将样品中许多痕量元素转化为溶解度高的硝酸盐，通常与H2O2共用，发生连锁反应，增强硝酸的消解能力，使样品消解更彻底。6 mL硝酸和2 mL过氧化氢消解体系，硝酸用量少，最终获得的样品消解溶液澄清透明，消解程序采用2次4步式温度梯度，应用于鲸豚额隆样品消解，获得的数据重复性好，效果理想。

2.2 干扰校正

ICP-MS分析技术中常见多种干扰，主要分为非质谱型干扰和质谱型干扰。非质谱干扰主要包括基体效应，抑制干扰，物理干扰，记忆效应等。非质谱干扰中，基体效应是常见的干扰，直接影响测定结果的稳定性和准确性。内标法能有效的校正样品测定过程中的信号漂移，同时能校正一般的基体效应，本研究为中华白海豚额隆中微量元素的测定选择了合适的内标元素：待测元素V，Cr和Mn采用Sc为内标元素；Cd采用In为内标元素；Hg和Pb采用Bi为内标元素；Ni，Cu，Zn，As和Se采用Ge为内标元素，有效的降低了基体效应。此外，还通过优化仪器条件等措施消除非质谱型干扰。质谱干扰主要包括同量异位素的叠加，多原子离子的叠加，氧化物和双电荷干扰等。测试样品基质主要组成元素为V，Ni，Cr，Mn，Cu，As，Zn，Hg，Se，Cd和Pb，这11个待测元素大多属于中质量元素，存在一定程度的质谱干扰，因此，本研究采用安捷伦第三代八极杆碰撞/反应池系统(ORS3)，利用He气撞击模式有效的消除多原子离子质谱干扰。

2.3 仪器检出限以及线性关系分析

在优化的实验和仪器测定条件下，重复测定试剂空白溶液11次，其测量结果标准偏差3倍所对应的浓度值即为检出限，本方法各待测元素的检出限如表3所示，其值在3.7×10-3～0.5 μg·L-1之间。

用V，Ni，Cr，Mn，Cu，As，Zn，Hg，Se，Cd和Pb的单元素标准储备溶液和1%HNO3溶液配制不同梯度的混合标准溶液，并用内标校正，建立标准曲线，线性回归方程及相关系数如表3。结果表明，各待测元素拟合系数良好，线性相关系数均不低于0.999 6。

表3 线性回归方程和相关系数

2.4 方法的准确度和精密度

为考察实验方法的准确度和精密度，在相同的试验条件和操作步骤下采用国际标准物质龙虾肝胰脏TORT-2进行验证性实验，样品平行测定6次，结果见表4。待测11种元素测定值均在参考值范围内，样品回收率在92.5%～102.9%，相对标准偏差在2.24%～3.77%之间，表明本方法具有良好的准确度和精密度。

2.5 中华白海豚额隆微量元素含量分析

应用优化方法对11头中华白海豚额隆样品进行分析，测定了V，Ni，Cr，Mn，Cu，As，Zn，Hg，Se，Cd和Pb共11种微量元素在额隆中的含量(结果见表5)。结果显示：不同个体间额隆中微量元素含量存在差异，这可能与个体状况有关。地理分布，食物组成，年龄，性别，器官分布及代谢率等因素也会影响海洋哺乳动物体内微量元素含量。其次，额隆中11种微量元素含量分布趋势相似，其平均含量从高到低排序依次为：Zn>As>Cu>Mn>Se>Hg>Cr>Ni>Pb>V>Cd，平均含量最高的是Zn，浓度达到12.4 μg·g-1，远高于其他元素含量，其次是As，为1.158 μg·g-1，含量最低的是Cd，平均含量仅为0.006 9 μg·g-1。

表4 标准物质测定结果

通常可以将微量元素划分为必需微量元素和非必需微量元素。在鲸豚中，必需微量元素主要包括Zn，Cu，Mn，Se等，通常被认为是无毒的，但是超过阈值时也会产生毒害作用[9-10]。非必需微量元素主要包括Hg，Cd，Cr和Pb等，即使在低浓度水平下也可能会产生毒害作用[10]。值得注意的是，As作为有毒微量元素，在额隆中具有较高含量，提示可能受到As危害，其他非必需元素含量均处于较低水平，可能对海豚健康影响不大。

2.6 中华白海豚额隆中微量元素相关性分析

利用SPSS20.0软件对中华白海豚额隆中的11种微量元素进行spearman相关性分析，结果如表6所示。通过分析可以看出，中华白海豚的体长与额隆中As(r=0.733)，Cd(r=0.615)，Hg(r=0.645)呈显著正相关(p<0.05)，表明这三种元素在中华白海豚额隆中存在一定的生物富集现象。生物富集是指生物体在生长发育过程中，直接通过环境和食物蓄积某些元素或难以分解的化合物的过程。一般来说，微量元素随年龄增长而增加，尤其是Hg和Cd，Cd和Hg都为重金属元素，在鲸豚体内大量积累会对其健康造成危害，而Se和Hg结合形成HgSe复合物[11]，而金属硫蛋白与Cd结合进行解毒，它们形成的化合物都较难排出体外而在体内富集。

另外，不同元素间存在着显著的相关性，如Cr与Ni呈显著正相关(p<0.05)，Mn与As呈显著负相关(p<0.01)。Cr主要来源于铬矿石的加工，金属表面处理，皮革鞣制，印染等过程，而Ni主要来源于镍矿石的冶炼，含镍燃料在燃烧过程中排出的废弃物，Cr与Ni都与人类活动密切相关，两者在中华海豚体内具有相关性对我们有一定的提示意义。Mn是海豚生长所需必需微量元素，对维持海豚的正常新陈代谢具有重要作用，而As是有毒元素，可能会对海豚产生神经毒害，生殖毒害等毒害，这两种元素呈负相关可能和两者与体长的关系有关。

表5 中华白海豚额隆微量元素含量(μg·g-1 ww)

nd: not detected

表6 中华白海豚额隆微量元素含量与体长Spearman相关性分析

*：Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed)；**：Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed)

2.7 中华白海豚额隆微量元素因子分析

对珠江口11头中华白海豚额隆的11种微量元素进行因子分析，额隆中微量元素的主成分分析结果见表7。SPSS因子分析结果显示，因子分析的变量V，Cr，Mn，Ni，Cu，Zn，As，Se，Cd，Hg和Pb的公因子方差值分别是0.844，0.894，0.817，0.871，0.755，0.715，0.677，0.669，0.842和0.842，共同度很高，表明11个变量中的大部分信息均能够被因子所提取，说明因子分析的结果是有效的。因子贡献显示，前4个主成分对应的特征值大于1，累计方差贡献率达到78.74%，因此提取前4个成分作为主因子。第一主成分贡献率为25.767%，特点是在V，Mn，Ni和Se上有较高的因子负荷，分别为0.769，0.633，0.823，-0.638。第二主成分贡献率为21.614%，有2种元素表现出高的因子负荷，与Cu高度正相关，与Zn高度负相关，因子负荷分别为0.609和-0.84，反映了必需微量元素对中华白海豚的影响。第三主成分贡献率16.809%，主要特征是在Cu和Hg上有较高负荷，与Cu负相关，与Hg高度正相关。第四主成分贡献率14.552%，仅在Pb一个因子上有较高的因子负荷，因子负荷为0.629。每个主成分均有与其高度相关的元素，这表明这4个主成分可较全面的反应出中华白海豚额隆中微量元素的主要信息。由表7可知，累计方差60%以上的贡献率来自前三个主成分，因此可认为V，Mn，Ni，Se，Cu和Hg为中华白海豚额隆主要特征微量元素。

3 结 论

(1)建立了微波消解ICP-MS法测定中华白海豚额隆中V，Cd，Cu，Zn，As，Cr，Ni，Mn，Se，Hg和Pb 11种微量元素的方法。通过选择Sc，Ge，In和Bi作为内标元素克服了基体效应和信号漂移对元素测定的影响，采用ORS3技术有效地校正了多原子离子质谱干扰。TORT-2标准参考物对照分析显示，待测元素的RSD在2.24%～3.77%之间，回收率在92.5%～102.9%之间，表明该实验方法具有良好的准确度和精密度，可用于额隆微量元素含量测定分析。

表7 中华白海豚额隆中11种微量元素主成分分析

(2)含量特征分析表明，微量元素在中华白海豚额隆中含量差异较大，这可能与个体年龄，捕食偏好，栖息地以及元素的富集模式差异有关。在额隆中，微量元素基线水平不高，必需微量元素为满足海豚生理所需而占有主导地位，整体对海豚危害性可能不大，但应对微量元素As多加关注，元素平均含量依次为Zn>As>Cu>Mn>Se>Hg>Cr>Ni>Pb>V>Cd。

(3)Spearman相关性分析结果表明，中华白海豚额隆中As，Cd和Hg三种微量元素含量与海豚体长呈显著正相关，揭示了这些元素在其额隆中有生物富集现象。同时发现Cr与Ni呈显著正相关，Mn与As呈显著负相关，揭示了元素间的相互关联性，为研究中华白海豚微量元素关系提供了参考。

(4)主成分分析结果表明，V，Mn，Ni，Se，Cu和Hg为中华白海豚额隆主要特征微量元素。这些结果为中华白海豚微量元素含量测定提供了有效的方法，同时为其保育工作提供了宝贵的参考信息。

致谢：在此感谢广东珠江口中华白海豚国家级自然保护区管理局对本研究的大力支持。

[1] Ye F, Huang X, Zhang D, et al. Journal of Environmental Sciences, 2012, 24(4): 579.

[2] Tanabe S, Iwata H, Tatsukawa R. Science of the Total Environment, 1994, 154(2): 163.

[3] Aubail A, Méndez-Fernandez P, Bustamante P, et al. Marine Pollution Bulletin, 2013, 76(1): 158.

[4] ZOU Yu-zhen, CAI Wan-ping, GU Sheng-ming(邹玉珍, 蔡琬平, 顾生明). Acta Theriologica Sinica(兽类学报), 1982，(1): 19.

[5] FU Liang, TANG You-gen, XIE Hua-lin(符 靓, 唐有根, 谢华林). Food Science and Technology(食品科技), 2012，(4): 291.

[6] Borrell A, Clusa M, Aguilar A, et al. Chemosphere, 2015, 122: 288.

[7] Borrell A, Aguilar A, Tornero V, et al. Chemosphere, 2014, 107: 319.

[8] Stavros H-C W, Stolen M, Durden W N, et al. Chemosphere, 2011, 82(11): 1649.

[9] Bryan G. Marine Ecology, 1984, 5(3): 1289.

[10] Méndez-Fernandez P, Webster L, Chouvelon T, et al. Science of the Total Environment, 2014, 484: 206.

[11] Yang J, Kunito T, Tanabe S, et al. Environ Pollut, 2007, 148(2): 669.

(Received Jun. 27, 2015; accepted Oct. 20, 2015)

*Corresponding author

Determination of Trace Elements in the Melon of Indo-Pacific Humpback Dolphins (Sousachinensis) with ICP-MS

ZHANG Ling-li1, 2, DING Yu-long1, 3, ZHANG Mei1, 3, GUI Duan1, 3, NING Xi2, 3, LI Jun1, 3, WU Yu-ping1, 3*

1. South China Sea Bio-Resource Exploitation and Utilization Collaborative Innovation Center, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China

2. School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China

3. School of Marine Sciences, Sun Yat-sen University, Zhuhai 519082, China

The Indo-Pacific humpback dolphins (Sousachinensis) with long life-span are top predators in marine ecosystem -and they could accumulate heavy metals and persistent organic pollutants in their tissues, while the melon is a unique lipid-rich structure within the cetacean forehead that functions in the transmission of echolocation signals. To explore the baseline levels and the main characteristics of the components, the concentrations of vanadium (V), nickel (Ni), chromium (Cr), manganese (Mn), copper (Cu), arsenic (As), zinc (Zn), mercury (Hg), selenium (Se), cadmium (Cd) and lead (Pb) were determined in the melon of the Indo-Pacific humpback dolphins with inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS). The results showed that this method was quite suitable for the determination of trace elements in the melon of Indo-Pacific humpback dolphins with highly accuracy and precision, and the trace elements in melon existed individual differences. The average contents were in the order of Zn>As>Cu>Mn>Se>Hg>Cr>Ni>V>Pb>Cd. It is worth noting that the within (1.158 μg·g-1ww), non-essential toxic trace element may cause toxic effect on the dolphins. Spearman correlation analysis showed positively significant correlations between As, Cd, Hg and body length, indicating that the concentrations of As, Cd, Hg may increase with age. Moreover, Cr and Ni were positively correlated (p<0.05), a significant negative correlation was observed between Mn and As (p<0.01), indicating that there are certain correlation among elements. In addition, the principal component analysis results showed that V, Mn, Ni, Se, Cu, Hg are the main characteristics of trace elements for melon. This study presents a reliable method for determination of the trace element analysis in cetacean melon, and this is the first study that reports the trance elements in the melon of the Indo-Pacific humpback dolphins in PRE that could provide reasonable and effective information for its conservation work.

Indo-Pacific humpback dolphins; Melon; Trace elements; Inductively coupled plasma mass spectrometry; Microwave digestion

2015-06-27，

2015-10-20

国家自然科学基金项目(41276147，41576128)，农业部中华白海豚保护行动计划，香港海洋公园保育基金项目资助

张灵莉，1991年生，中山大学生命科学大学院硕士研究生 e-mail：13543018893@163.com *通讯联系人 e-mail：exwyp@163.com

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)10-3326-06