抗菌肽Temporin-1CEa及其改造肽抑制血管新生和黑色素瘤转移侵袭的作用研究

任会丹，张琳†，赵颖，司新红，张亮，王澈 ,2Δ

(1.辽宁师范大学 化学与化工学院，辽宁 大连 116029；2.辽宁省生物技术与分子药物研发重点实验室，辽宁 大连 116081)

抗菌肽Temporin-1CEa及其改造肽抑制血管新生和黑色素瘤转移侵袭的作用研究

任会丹1，张琳1†，赵颖1，司新红1，张亮1，王澈1,2Δ

(1.辽宁师范大学 化学与化工学院，辽宁 大连 116029；2.辽宁省生物技术与分子药物研发重点实验室，辽宁 大连 116081)

目的 筛选抗菌肽Temporin-1CEa及其6种改造肽对人黑色素瘤A375细胞增殖的抑制作用，并考察其在体外对A375细胞转移侵袭和血管新生的影响。方法 MTT法检测细胞生长抑制率；细胞划痕实验和Transwell实验检测细胞的迁移/侵袭能力；体外基质胶小管实验检测血管生成，ELISA实验检测细胞MMP-2和VEGF的释放量。结果 Temporin-1CEa及其改造肽LK1，LK2(6)A(L)，对A375细胞增殖具有较强的抑制活性，而对人永生化表皮细胞HaCat的细胞毒作用较弱；同时，这3种肽对人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的增殖亦具有较强的抑制作用，提示其可能具有血管新生抑制活性。HUVEC细胞划痕实验、Transwell实验和体外基质胶小管实验，进一步证实这3种肽确实能够有效的抑制HUVEC细胞的迁移，并对血管新生产生浓度依赖性的抑制作用。A375细胞Transwell实验结果表明，这3种肽还能够显著地抑制A375细胞的迁移和侵袭。ELISA实验结果表明，这3种肽的上述作用可能与其显著降低A375细胞的MMP-2和VEGF释放量有关。结论 Temporin-1CEa及其改造肽LK1和LK2(6)A(L)不仅对黑色素瘤A375细胞具有较强的选择性细胞毒作用，并抑制其迁移和侵袭，还具有较好的血管新生抑制活性，有望成为新型的抗黑色素瘤治疗药物。

抗菌肽；黑色素瘤；血管新生；转移；侵袭

肿瘤的恶性增殖靠营养和氧来维持，肿瘤周围的新生血管可以提供这2种必需物，而新生血管的形成还会促进肿瘤细胞的转移和侵袭[1]。有研究证明，人血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)在肿瘤细胞中的表达水平与血管密度、肿瘤的生长速率和转移侵袭密切相关[2]。其中，VEGF作为一种有效的促血管生成因子，可以促进内皮细胞增殖、迁移和分化[3]。而MMPs则在肿瘤转移侵袭过程中发挥重要的作用。黑色素瘤是最具侵袭性的恶性肿瘤之一，死亡率高[4]，外科手术预后差，极易发生转移[5]，所以开发新型抗黑色素瘤药物并且研究通过抑制血管新生干预黑色素瘤的转移侵袭具有一定的理论和实际价值。

阳离子抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是天然免疫系统的一种小分子多肽，其分子量较小，具有明显的两亲性，带正电荷，使其对细胞膜带负电荷物质较多的肿瘤细胞具有较强的选择性，而对正常哺乳动物细胞的毒性较小。本实验室自主开发的Temporin-1CEa是从中国林蛙皮肤分泌物中提取的的天然阳离子抗菌肽，由17个氨基酸残基组成，带3个净正电荷，具有典型的两亲性α-螺旋结构，对多种人肿瘤细胞产生不同程度的抑制活性[6]；此外，本研究还以Temporin-1CEa为模板，通过改变其电荷和疏水性设计出6种改造肽LK1、LK2(6)、LK2(5)、LK3、LK2(6)A(L)、LK2(6)AN(2L)。前期研究结果发现Temporin-1CEa对人黑色素瘤A375细胞的抑制作用较强，而肿瘤细胞膜表面所带负电荷物质则是此类阳离子抗菌肽选择性抑制肿瘤细胞增殖的重要原因之一[7]。本论文将对Temporin-1CEa及其改造肽抑制人黑色素瘤A375细胞增殖的作用进行筛选，并考察其对血管新生以及A375细胞转移侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：人黑色素瘤A375细胞(中科院上海细胞库)；人永生化表皮HaCat细胞(南京凯基生物科技发展有限公司，人脐静脉血管内皮HUVEC细胞(南京凯基生物科技发展有限公司)。

1.1.2 药品与试剂：Temporin-1CEa及其改造肽(上海吉尔生化有限公司)；MTT(Sigma公司)；人基质金属蛋白酶-2(MMP-2)酶联免疫试剂盒和人血管内皮生长因子(VEGF)酶联免疫试剂盒(上海春晓生物技术有限公司)；其他分析纯试剂(哈尔滨化工化学试剂厂)。

1.1.3 实验仪器：IX71倒置荧光显微镜(Olympus)；Multiskan Ascent®microplate reader酶标仪(Thermo Scientific)；Transwell小室Transwell insert(Corning公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测细胞增殖抑制作用：取对数生长期的A375和HaCat细胞，配成5×104个/mL细胞悬液，每孔100 μL接到96孔板中，于37 ℃、5%CO2培养过夜后进行实验，设有对照组与加肽组：对照组只有细胞液不外加任何物质；加肽组加入抗菌肽Temporin-1CEa及其改造肽，终浓度为5、10、20、40、60、80和100 μM，作用1 h，加入MTT培养4 h后，弃上清再加入DMSO，在492 nm下用酶标仪测定OD值，重复3次。按照公式计算细胞存活率：

筛选出对A375细胞有选择性的抗菌肽进行后续实验，用上述方法测筛选后的抗菌肽对HUVEC细胞增殖抑制作用。

1.2.2 细胞划痕实验：取对数期生长的HUVEC细胞, 以1×105个/mL(2 mL/孔)密度接种到6孔板中，于37 ℃、5%CO2条件下孵育48 h后，将原培养液吸去，用200 μL移液器吸头在单层细胞上呈“一”字型划痕，用PBS洗2～3次，加入无血清培养液，饥饿处理4 h，吸去培养液，加入含5%FBS培养液，再加入血管内皮生长因子VEGF继续培养，对照组肽的浓度为0 μM，实验组使肽的终浓度为2.5、5、10、20、25 μM处理1 h后，在倒置荧光显微镜20倍下观察并拍照。

1.2.3 Transwell检测细胞迁移能力：Transwell小室放置在24孔板，取500 μL培养液，将HUVEC细胞和A375细胞接种在上室，并向A375细胞Transwell下室加入VEGF，实验分为对照组和加肽组，对照组肽的浓度为0 μM，实验组分别向2组细胞Transwell上室加入2.5、5、10、15、20和25 μM的Temporin-1CEa、LK1及LK2(6)A(L)。16 h过后除去小室上表面的细胞，下侧固定于10%福尔马林缓冲液1 h，PBS洗涤3～5次后用HE(苏木精—伊红)染色。脱色，干燥后，使用倒置荧光显微镜20倍下观察并照相。按照公式计算细胞迁移抑制率：

1.2.4 体外血管生成检测：基底胶溶液以每孔150 μL涂于24孔板中，排除基质胶中的气泡，冰上放置20 min后，放置37 ℃孵育30 min。HUVEC细胞以4×104个/mL密度接种在基质胶上面，每孔1 mL。经过12 h，37 ℃孵育，加入浓度为2.5、5、10、15、20和25 μM的Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)作为实验组，对照组肽的浓度为0 μM，作用1 h，使用倒置荧光显微镜20倍下采集图像， 计数形成管腔个数。

1.2.5 ELISA方法检测A375细胞释放MMP-2和VEGF含量： 培养A375细胞，将处在对数生长期的细胞接板，细胞密度为5×104个/mL，每孔100 μL接种于96孔板中，37 ℃、5%CO2过夜培养后进行实验。对照组只有细胞液不外加任何物质；加肽组加入终浓度为1.25、2.5、10和15 μM的Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)，作用30 h后收集不同浓度的肽作用细胞的上清液，3000 r/min，20 min。按人基质金属蛋白酶-2(MMP-2)酶联免疫试剂盒和人血管内皮生长因子(VEGF)酶联免疫试剂盒说明书检测MMP-2和VEGF含量。

以上实验均重复3次。

2 结果

2.1 MTT比色法检测Temporin-1CEa及其改造肽对A375、HaCat和HUVEC细胞的增殖抑制作用 由表1中可以看出LK2(5)作用于A375和HaCat的IC50超过100，说明这2种肽对细胞的抑制作用很不显著，筛选出IC50在30 μM以下的肽，分别为Temporin-1CEa、LK1、LK2(6)A(L)和LK2(6)AN(2L)，这4种肽对A375细胞具有显著的增殖抑制作用，但LK2(6)AN(2L)对HaCat IC50( μM)值大于A375细胞的，这说明LK2(6)AN(2L)对正常细胞的毒性较癌细胞强，所以最后筛选出Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)3种肽作为后续研究的材料。

抗菌肽A375细胞IC50值HaCat细胞IC50值Temporin⁃1CEa18 20±3 7450 60±3 05LK127 79±4 8148 20±2 41∗LK2(5)>100>100LK2(6)95 65±3 0071 87±3 47LK346 25±4 16>100LK2(6)A(L)16 81±1 7945 00±5 17LK2(6)AN(2L)11 48±3 5717 93±2 05∗

Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)这3种肽对HUVEC细胞增殖抑制见表2，结果表明Temporin-1CEa，LK1，LK2(6)A(L)均能够明显抑制HUVEC细胞的增殖，且存在统计学意义(P<0.05)说明这3种肽具有潜在的抗血管新生的活性。

抗菌肽HUVEC细胞IC50值Temporin⁃1CEa30 99±1 31LK126 16±1 25LK2(6)A(L)23 05±2 82

2.2 Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)抑制HUVEC细胞迁移实验 细胞划痕实验用于证明细胞迁移作用，实验选取2.5、5、10、15、20、25 μM浓度的3种肽作用HUVEC细胞1 h，进行细胞划痕实验。与对照组相比，加肽组随着肽浓度的增大，细胞迁移的距离在逐渐减小，迁移出来的细胞数量减少，迁移抑制率统计结果见图1，迁移抑制率随着肽浓度的增大而增大。

图1 Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)对HUVEC细胞划痕/迁移的抑制作用(n=3)Fig.1 Inhibitory effect of Temporin-1CEa, LK1 and LK2 (6) A (L) on HUVEC migration in scratch/migration test(n=3)

Transwell实验检测HUVEC细胞迁移的数量，随着肽浓度的增加，从Transwell小室的上室迁移到下表面的细胞数量明显减少，说明Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)对HUVEC细胞迁移有抑制作用，迁移抑制率见图2。

图2 Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)对HUVEC细胞迁移/侵袭的抑制作用(n=3)Fig.2 Inhibitory effect of Temporin-1CEa, LK1 and LK2 (6) A (L) on HUVEC migration in migration/invasion test(n=3)

2.3 Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)抑制HUVEC细胞的血管生成能力 通过基质胶小管形成的实验来检测抗菌肽对HUVEC血管生成的影响，结果显示，当胶肽浓度为15 μM时，HUVEC细胞形成的网状数量均开始减少，网状结构开始变细，随着基质胶中肽浓度的逐步提高，这种网状结构显著减少，存在的完整管腔则几乎不存在。结果表明，Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)可抑制HUVEC管腔形成，并呈一定的剂量依赖性，管腔抑制率见图3。

图3 Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)对HUVEC细胞基质胶小管形成的抑制作用(n=3)Fig.3 Inhibitory effect of Temporin-1CEa, LK1 and LK2 (6) A (L) on HUVEC cell matrigel tubule formation(n=3)

2.4 Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)抑制A375细胞迁移/侵袭实验 随着肽浓度的增加，从Transwell小室的上室迁移到下表面的细胞数量越来越少，细胞聚集程度越来越低，说明Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)对A375细胞侵袭的抑制作用在明显增加，迁移抑制率见图4。

图4 Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)对A375细胞迁移/侵袭的抑制作用(n=3)Fig.4 Inhibitory effect of Temporin-1CEa, LK1 and LK2 (6) A (L) on A375 migration in migration/invasion test(n=3)

2.5 Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)对人黑色素瘤A375细胞释放MMP-2和VEGF的影响 随着肽浓度的增加，A375细胞释放MMP-2的量越来越少，当肽浓度达到15 μM时，MMP-2的释放量已低至较低水平，表明Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)对A375细胞释放的MMP-2呈现剂量依赖性的抑制作用。抑制肿瘤细胞释放VEGF，则可以有效抑制血管新生，同时抑制肿瘤的转移侵袭。随着肽浓度的增加，A375细胞释放VEGF的越来越少，当肽浓度达到15 μM时，MMP-2的释放量已经达到较低水平，说明Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)对A375细胞释放的VEGF呈现剂量依赖性的抑制。见图5。

图5 ELISA 方法检测Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L) 对A375细胞中MMP-2和VEGF释放的影响Fig.5 Effects of Temporin-1CEa、LK1 and LK2(6)A(L) on MMP-2 and VEGF secretion of A375 cells detected by ELISA

3 讨论

目前，临床应用的多数化疗药物对肿瘤细胞和正常细胞均存在杀伤作用，副反应较多，且容易产生耐药。黑色素瘤是最常见的皮肤癌类型，占所有的皮肤死亡癌症的80%以上，其恶性程度高，很容易发生转移。因此，寻找到一种不仅能选择性杀伤黑色素瘤细胞，还可以成功破坏黑色素瘤细胞周围新生血管，并抑制黑色素瘤转移侵袭的新型药物是非常有意义的[8]。

本实验室前期工作对Temporin-1CEa及其6种改造肽进行研究，证实它们对多种肿瘤细胞增殖有较强的抑制作用[9]。Temporin-1CEa及其改造肽属于阳离子α-螺旋膜活性多肽，这类肽作用于细胞时，其阳离子净电荷和两亲性α-螺旋结构更易于与表面负电荷物质多于正常细胞的癌细胞膜发生静电吸引和结合[7]，破坏细胞膜的结构甚至形成孔洞，使细胞内容物外泄。由于这种特殊的作用机制，使得此类肽可以选择性地杀伤癌细胞，对非肿瘤细胞毒性较小，且不易产生耐药。在本文对人黑色素瘤A375细胞的研究中，发现7种肽中，Temporin-1CEa、LK1和LK2(A)(L) 能够选择性抑制A375细胞增殖，对HaCat细胞毒性较小。

实体肿瘤包括肿瘤组织和基质细胞，肿瘤细胞通过与基质细胞之间的相互作用营造出器官特异性的微环境，来促进肿瘤生长和转移[10]。在没有新血管生成以前, 肿瘤不会发生转移，而在新血管生成后肿瘤细胞不仅会以更快的速度成倍增长, 转移的机会也随之增高[11]。肿瘤细胞的转移侵袭不仅需要释放MMP-2来降解细胞外基质，还通过释放VEGF来促进肿瘤自身新生血管的生成，血管生成的刺激，能够增加细胞运动性，促进细胞分裂，进而增强肿瘤的恶性增殖和转移侵袭[12-14]。

本研究通过3个实验在不同层面反映血管生成的过程，细胞划痕迁移模拟了细胞平面迁移能力，迁移与侵袭模拟了真实环境中内皮细胞的转移性，基质胶小管则模拟了血管形成，实验结果表明Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)对HUVEC细胞的生长、细胞划痕/迁移、迁移/侵袭和管腔的形成均表现出不同程度的抑制作用。在A375细胞的侵袭性实验中，Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)能够抑制A375细胞在趋化因子的作用下穿过Transwell聚碳酸酯膜。同时ELISA实验结果显示Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)还能减少A375细胞MMP-2和VEGF的释放。

综上所述，阳离子抗菌肽Temporin-1CEa及其改造肽基于其特殊的作用机制对人黑色素瘤A375细胞产生选择性的抑制作用，并能抑制与黑色素瘤发生发展密切相关的血管新生和转移侵袭, 这将为阳离子抗菌肽抗血管新生和肿瘤转移侵袭的机制研究以及新型抗黑色素瘤多肽药物的开发提供理论依据和新的思路。

[1] Yilmaz M，Christofori G，Lehembre F.Distinct mechanisms of tumor invasion and metastasis[J].Trends Mol Med, 2007, 13(12):535-541.

[2] Mantovani A, Allavena P, Sica A, et al.Cancer-related inflammation[J].Carcinogenesis, 2009, 30(7):1073-1081.

[3] Garbe C, Leiter U.Melanoma epidemiology and trends[J].Clin Dermatol, 2009, 27(1):3-9.

[4] Makovitzki A, Fink A, Shai Y.Suppression of human solid tumor growth in mice by intratumor and systemic inoculation of histidine-rich and pH dependent host defense-like lytic peptides[J].Cancer Research, 2009, 8(69):3458-3463.

[5] Neagu M， Constantin C， Zurac S.Immune parameters in the prognosis and therapy monitoring of cutaneous melanoma patients: experience， role， and limitations[J].BioMed Research International, 2013, 2013(1):107940-107952.

[6] Wang C,Li HB,Li S, et al.Antitumor effects and cell selectivity of temporin-1CEa,an antimicrobial peptide from the skin secretions of the Chinese brown frog (Rana chensinensis)[J].Biochimie, 2012, 94(2):434-441.

[7] Wang C, Chen YW,Zhang L,et al.Melanoma cell surface-expressed phosphatidylserine as a therapeutic target for cationic anticancer peptide, temporin-1CEa[J].J Drug Target,2015, DOI: 10.3109/1061186X.2015.1113539.

[8] Huang YB, He LY, Jiang HY, et al.Role of helicity on the anticancer mechanism of action of cationic-helical peptides[J].Int J Mol Sci, 2012, 13(6):6849-6862.

[9] Yang QZ, Wang C, Lang L, et al.Design of potent,non-toxic anticancer peptides based on the structure of the antimicrobial peptide,temporin-1CEa[J].Arch Pharm Res, 2013, 36(11):1302-1310.

[10] Wang C, Tian LL,Li S.Rapid cytotoxicity of antimicrobial peptide temporin-1CEa in breast cancer cells through membrane destruction and intracellular calcium mechanism[J].PLoS ONE, 2013, 90(20-21):1004-1014.

[11] Steinstraesser L, Hauk J, Schubert C et al.Suppression of soft tissue sarcoma growth by a host defense-like lytic peptide[J].PLoS One, 2011, 6(3):18321.

[12] Mantovani A, Allavena P, Sica A and Balkwill F.Cancer related inflammation[J].Nature, 2008, 454(7203):436-444.

[13] Whiteside TL.The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth[J].Oncogene, 2008, 27(45):5904-5912.

[14] 王拴柱,马秀梅.细胞外基质与肿瘤转移关系的研究进展内蒙古医学院学报[J].内蒙古医学院学报,2009,31(1):76-80.

(编校：王冬梅)

Study on inhibitory effect of antimicrobial peptide Temporin-1CEa and its analogues inhibit metastasis and invasion of human melanoma A375 cells and reduce angiogenesis

REN Hui-dan1, ZHANG Lin1†, ZHAO Ying1, SI Xin-hong1, ZHANG Liang1, WANG Che1,2Δ

(1. Chemistry and Chemical Engineering, Liaoning Normal University, Dalian 116029, China; 2. Key Laboratory of Biotechnology and Molecular Drug Development in Liaoning Province, Dalian 116081, China)

ObjectiveTo screen the inhibitory effects of antimicrobial peptide Temporin-1CEa and its analogues on human melanoma A375 cells proliferation. And to evaluate their impacts on A375 cells metastasis and invasion and their angiogenesis reduction activity in vitro further.MethodsCell proliferation inhibition ratio was detected by MTT assay. The ability of migration/invasion was determined by wound/healing test and transwell test. Tubule formation assay was performed to investigate the effects of peptides on angiogenesis. The release of MMP-2 and VEGF was detected by ELISA.ResultsMTT results indicated that Temporin-1CEa and two of its analogues, LK1 and LK2(6)A(L), significantly inhibited A375 cells proliferation without significant cytotoxicity to human keratinocyte HaCaT cells. Moreover, the proliferation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) was also inhibited by these peptides, suggesting an angiogenesis inhibitory activity. The data from HUVEC wound/healing test, transwell test and tubule formation assay further confirmed the migration inhibition and angiogenesis reduction activities of these three peptides, in a dose-dependent manner. In addition, these peptides also inhibited the migration of A375 cells in transwell test. Consistently, the ELISA data further supported that the metastasis/invasion inhibitory activities and angiogenesis reduction potential of temporin-1CEa and their analogues on A375 cells might be due to the decreased MMP-2 and VEGF secretion.ConclusionTemporin-1CEa and its analogues not only exerte potent and selective cytotoxicity to A375 cells, but also inhibite A375 cells metastasis and invasion and reduce angiogenesis, therefore, have the potential to be a new type anti-melanoma drugs.

antimicrobial peptides; melanoma; angiogenesis; metastasis; invasion

国家自然科学基金(81202448)；国家级和辽宁省大学生创新创业训练计划(201510165004)

任会丹，女，本科在读，研究方向：药学，E-mail：641769183@qq.com；共同第一作者，张琳，女，硕士在读，研究方向：抗菌肽对乳腺癌细胞作用机制，E-mail：1165487541@qq.com；王澈，通信作者，女，博士，硕士生导师、副教授，研究方向：天然药物抗肿瘤机制研究及应用，E-mail：wangche126@126.com。

R963

A

1005-1678(2016)02-0019-04