増液承气汤对热结肠道型气分证大鼠肠道组织结构、血清IL-1β、IL-6及TNF-α含量的影响

王自力，王晓谦，张　翥，涂君平，蒋会会，别应堂，张家骅

(1.西南大学动物科技学院，重庆 400715；2.重庆市光大(集团)有限公司，重庆 400020)



増液承气汤对热结肠道型气分证大鼠肠道组织结构、血清IL-1β、IL-6及TNF-α含量的影响

王自力1，2，王晓谦1，张翥1，涂君平1，蒋会会1，别应堂2，张家骅1

(1.西南大学动物科技学院，重庆 400715；2.重庆市光大(集团)有限公司，重庆 400020)

摘要：为了探讨增液承气汤对热结肠道型气分证大鼠肠道组织结构及血清炎性细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α含量的影响，给热结肠道型气分证模型大鼠预防性或治疗性灌服增液承气汤，测定大鼠体温、体重、肠道黏膜组织结构变化和血清相关炎性细胞因子含量。结果表明：热结肠道型气分证大鼠肠道屏障功能受损，肠道黏膜脱落，部分绒毛断裂，炎性细胞浸润，上皮内淋巴细胞(IEL)数量增多，杯状细胞(GC)数量减少，且血清中炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α均会出现显著升高(P<0.05)。预防性给予增液承气汤后，可有效减轻肠道黏膜脱落，绒毛断裂和炎性细胞浸润等损伤，并能有效降低大鼠血清中IL-6和TNF-α含量(P<0.05)；治疗性给予增液承气汤能有效地降低大鼠体温，使大鼠肠道组织结构基本恢复正常，恢复肠道黏膜免疫屏障功能，可有效降低大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量。增液承气汤可通过降低体温、维护肠道组织结构正常，降低IEL及升高GC细胞数量，抑制血清炎性细胞因子的分泌而起到良好的防治作用。

关键词：增液承气汤；热结肠道气分证；肠道组织结构；炎性细胞因子

高热性疾病属于中兽医学的温病学范畴，可用清代温病学家叶天士创立的卫气营血辨证。其中，气分证是正盛邪实、正邪相争激烈、阳热亢盛的里热证，而增液承气汤是治疗热结肠道型气分证的经典方，由大黄、芒硝、生地、玄参、麦冬等组成，具有滋阴、清热、通便以治疗大便秘结的功效，可用于治疗热结胃肠引起的便秘[1]。研究表明，增液承气汤主要用于临床治疗功能性、糖尿病性、脑梗塞及外伤性便秘，中风，喘症，肠梗阻等疾病[2]，并能用于治疗5-HT3受体拮抗剂所致的便秘，提高其止吐效果[3]，但增液承气汤对热结肠道型气分证动物肠黏膜组织结构及其免疫机能的影响及作用特点尚无相关研究。因此，作者通过研究增液承气汤对热结肠道气分证大鼠肠道组织结构、IEL和杯状细胞(goblet cells，GC)数量及血清炎性细胞因子含量的变化，以探讨增液承气汤对热结肠道型气分证大鼠的作用效果及机制。

1材料与方法

1.1动物及分组

雄性SD大鼠24只，体重150～180 g，购自重庆市第三军医大学实验动物中心。随机分为对照组、模型组、中药预防组、中药治疗组，每组6只，饲养于25 ℃、65%湿度环境下，自由采食和饮水，适应性饲养7 d后开始试验。

1.2药品及仪器

大鼠IL-1β、IL-6及TNF-α ELISA试剂盒均购自上海蓝基生物科技有限公司。

热性中药：取中药肉桂、干姜、白附片(购自四川道福堂药业有限公司)按1∶1∶1比例，水煎2次，收集和合并滤液，经80 ℃、0.1 MPa减压蒸发浓缩至含生药1 g·mL-1，于4 ℃保存备用。

增液承气汤：由玄参30 g、麦冬24 g、生地24 g、大黄9 g，芒硝5 g(购自北京同仁堂药店重庆大溪沟分店)组成。水煎两次，收集滤液后减压浓缩至1 g·mL-1药液，于4 ℃保存备用。

RE-52A型旋转蒸发仪，XSZ-4G型光学生物显微镜，HH-2型恒温水浴锅，FA1004型电子天平，SW-CF-2FD型超净工作台，RM223型轮转组织切片机，BIO-RAD 680型酶标仪。

1.3试验方法

1.3.1大鼠热结肠道气分证模型的制作参照文献[4]方法制作大鼠热结肠道型气分证模型，即将中药肉桂、干姜、白附片浓缩液按剂量20 g·kg-1给SD大鼠灌胃用药12 d，禁食(不禁水)12 h后灌服100 g·L-1大鼠自身粪便混悬液2 mL，每天2次，连续2 d，第3天腹腔注射1011·mL-1大肠杆菌灭活菌液0.2 mL，5 h后即可形成热结肠道型气分证模型。

1.3.2动物处理对照组大鼠灌服生理盐水12 d，禁食12 h后，再灌服粪便悬浮液2 d，注射灭菌生理盐水5 h后采样；模型组在制作热结肠道性气分证模型后立即采样；预防组大鼠灌服热性中药及粪便悬浮液后，于注射灭活大肠杆菌液前0、6、12、18、24 h分别按1.94 mL·200 g-1给大鼠灌服增液承气汤，于注射灭活大肠杆菌液后第42小时采样；治疗组大鼠在制作热结肠道型气分证模型后0、6、12、18、24 h用增液承气汤按1.94 mL·200 g-1灌胃，注射灭活大肠杆菌液42 h后采样。

1.3.3检测指标及方法制作热结肠道型气分证前后及末次灌服中药后测定各组大鼠体温，制作石蜡切片，HE染色观察十二指肠、空肠及回肠组织结构变化，并取每只大鼠各肠段不相邻的5张切片，计数每张切片每100个肠黏膜柱状上皮细胞间的淋巴细胞(IEL)和杯状细胞(GC)的数量变化；同时进行眼球采血，3 000 r·min-1离心10 min分离血清，ELISA检测IL-1β、IL-6和TNF-α含量，操作步骤参照试剂盒说明书进行。

1.4数据处理及分析

2结果

2.1大鼠体温的变化

由表1可知，在制作热结肠道型气分证后，模型组、预防组和治疗组大鼠体温均显著高于对照组(P<0.05)；在分别预防性和治疗性给予增液承气汤后，预防组大鼠和治疗组大鼠体温均有效下降，显著低于模型组但高于对照组(P<0.05)。

℃

同行数据后所标字母相异表示差异显著(P<0.05)，所标字母相同表示差异不显著(P>0.05)

Different letters in the same row means significant difference between the treatments(P<0.05)，same letter in the same row means not significant difference between treatments (P>0.05)

2.2大鼠肠道组织结构变化

由图1-A、E、I、M可知，对照组大鼠肠道组织结构完整，十二指肠、空肠、回肠和结肠无明显病理变化，绒毛整齐，走向平直；由图1-B、F、J、N可知，模型组大鼠肠道组织均出现了明显病理损伤，如十二指肠有显著的炎性细胞浸润；空肠和回肠均出现了黏膜脱落、炎性细胞浸润等病理损伤。

由图1-C、G、K、O可知，预防组大鼠肠黏膜组织比较完整，绒毛排列整齐，上皮细胞形态正常，除十二指肠(图1-C)绒毛顶端有轻微损伤，没有黏膜水肿、充血或者炎性细胞浸润等病理现象；由图1-D、H、L、P可知，治疗组大鼠肠道组织中，肠黏膜组织比较完整，绒毛排列整齐，绒毛顶端无脱落，上皮细胞形态较完整，黏膜内偶有充血除十二指肠(图1-D)有轻微损伤，且较预防组损伤轻微。

2.3大鼠肠道IEL和GC数量的变化

由表2可知，与对照组相比，模型组大鼠各肠段IEL数量显著高于对照组(P<0.05)，预防组和治疗组大鼠的十二指肠和空肠的IEL数量均显著高于对照组(P<0.05)，但显著低于模型组(P<0.05)；预防组大鼠回肠IEL数量显著高于对照组(P<0.05)，且和模型组无显著差异(P>0.05)；治疗组大鼠回肠的IEL数量显著低于模型组(P<0.05)。

由表2可知，与对照组相比，模型组大鼠空肠、回肠的GC数量显著低于对照组(P<0.05)，十二指肠中的GC数量则显著高于对照组(P<0.05)；预防组和治疗组各个肠段的GC数量均显著高于对照组和模型组大鼠(P<0.05)。

2.4大鼠血清中各细胞因子含量变化

由表3可知，与对照组相比，模型组大鼠血清IL-1β、IL-6及TNF-α含量均显著高于对照组(P<0.05)；预防组大鼠血清IL-1β含量显著高于对照组(P<0.05)，IL-6含量显著低于模型组(P<0.05)且与对照组无显著差异(P>0.05)，TNF-α含量显著高于对照组(P<0.05)但显著低于模型组(P<0.05)；治疗组大鼠血清IL-1β及IL-6含量均显著低于模型组(P<0.05)且与对照组无显著差异(P>0.05)，TNF-α含量显著高于对照组(P<0.05)但显著低于模型组(P<0.05)。

组别GroupIEL数量NumbersofIELGC数量NumbersofGC十二指肠Duodenum空肠Jejunum回肠Ileum十二指肠Duodenum空肠Jejunum回肠Ileum对照组Controlgroup18.67±2.31a19.86±2.34a25.00±1.10b7.67±0.57a16.80±2.68b23.80±2.28b模型组Modelgroup26.25±2.99c24.00±1.58c28.50±1.91c9.75±1.71b12.00±0.71a17.33±1.03a预防组Preventiongroup22.25±2.67b21.75±2.90b27.25±4.82c10.25±2.17c19.25±2.28c25.00±2.74c治疗组Treatmentgroup21.25±3.13b22.25±2.16b25.75±3.03a11.75±1.92c20.50±3.91c26.50±2.29c

同一列中肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，下表同

In the same column，values with different lowercase superscripts mean significant difference (P<0.05)，the same as fellow

pg·mL-1

3讨论

热证本质与动物机体免疫和炎症过程密切相关，气分证患者血浆内毒素含量升高[5]，IL-1是炎症反应过程中最早被动员的细胞因子[6]，IL-6水平增高是机体最早出现感染的指标[7]，TNF-α和细胞膜上的特异性受体结合可抑制宿主的免疫功能[8]，IL-1、IL-6和TNF-α又是公认的内生致热源，阻断这些因子可防止机体体温升高[9]。完整的肠道组织结构是机体的第一道防线，主要由IEL和GC等免疫细胞和细胞因子共同完成屏障作用[10]，当肠道组织出现病理变化时，IEL和GC的数量也会相应变化。

3.1增液承气汤对热结肠道型气分证大鼠体温的影响

热结肠道型气分证是邪热内炽的证候，通过单次脂多糖静脉注射家兔可类似制作温病中卫、气分证的模型，可造成家兔体温明显升高[11]。本研究表明，构建热结肠道型气分证后，模型组、中药预防组和中药治疗组大鼠体温均显著高于对照组，表明热结肠道型气分证模型制作成功；预防性和治疗性给予增液承气汤可在一定程度上降低大鼠体温，且治疗性给药疗效优于预防性给药疗效，表明增液承气汤具有清解气分，活血化瘀的功效。有研究表明，气分证模型家兔灌服白虎汤体温仍会升高，但热势不明显[12]。

3.2增液承气汤对热结肠道性气分证大鼠肠道组织结构、IEL及GC数量的影响

3.2.1大鼠肠道组织结构的变化正常情况下，黏膜上皮细胞是机体更新最快的组织，且上皮细胞间紧密联系、无坏死。内毒素注入动物体内与细胞组分形成的中间产物，可致细胞溶解、黏附和损伤，可引起内脏组织器官损伤[4]。

本研究表明，大鼠在热结肠道型气分证情况下，肠道组织明显病理损伤，有炎性反应趋势，如十二指肠、空肠和回肠均出现了黏膜脱落、炎性细胞浸润等病理损伤，与前述研究结果一致[4]；预防性给予增液承气汤后，大鼠肠道黏膜组织较完整，绒毛排列整齐，上皮细胞形态正常，可有效保护肠道，除十二指肠绒毛顶端有轻微损伤外，无明显的黏膜水肿、充血或者炎性细胞浸润等病理现象，说明预防性给予增液承气汤可有效保护大鼠肠道组织结构。而治疗组大鼠在使用增液承气汤后肠黏膜组织比较完整，绒毛排列整齐，绒毛顶端没有脱落，上皮细胞形态完整，黏膜内偶有充血，除十二指肠有轻微损伤，且较预防组损伤轻微，可见肠道屏障系统的恢复明显，机体炎症已经得到有效控制，表明增液承气汤对热结肠道型气分证大鼠肠道组织损伤具有良好的治疗效果。研究表明，使用大承气汤和复方丹参合剂可有效减轻肠梗阻大鼠小肠上皮细胞肿胀、充血、渗出和溃疡以及炎性细胞浸润程度[13]。

3.2.2大鼠肠道IEL及GC数量的变化在动物肠道黏膜免疫系统中，IEL作为最先发生免疫反应的细胞，其数量多少与肠道杀灭病原微生物的效果和吞噬抗原的能力密切相关[13]；GC细胞可分泌含有糖蛋白的黏液润滑上皮表面，可聚合黏性糖蛋白保护上皮细胞，加强动物机体的防御功能[14]，在肠黏膜损伤后的重建过程中也起关键作用。因此，可根据IEL及GC数量来评价免疫防御功能的完善度和免疫屏障的完整性。

本研究表明，热结肠道气分证大鼠的IEL数量显著高于对照组，机体发生了炎症感染。预防性给予增液承气汤使大鼠十二指肠和空肠内的IEL数量显著减少，治疗性给予增液承气汤使大鼠的各肠道内IEL数量显著减少，说明增液承气汤亦可有效预防和治疗热结肠道型气分证大鼠肠道炎症，能有效维护大鼠肠道黏膜免疫机能的正常。研究表明，大承气颗粒药物灌胃大鼠的含药血清能使小鼠IEL显著增殖，IEL生长曲线维持在稍低于正常血清的较高水平，并且呈平稳的上升趋势，对维护肠道免疫有重要的意义[15]。因此，增液承气汤可降低热结肠道型气分证大鼠肠道IEL数量和减轻肠道炎症的发生。

本研究表明，热结肠道型气分证大鼠肠道GC细胞分泌黏液的功能下降，降低了肠道的润滑程度，导致大鼠燥粪的出现，可能减弱了肠道传输功能；预防性和治疗性给予增液承气汤后，可显著增加大鼠肠道GC数量，表明增液承气汤可促使肠道黏膜GC细胞数量增加，使得较多杯状细胞分泌黏液润滑和保护上皮组织以维护肠道黏膜免疫屏障功能的正常。研究表明，增液承气汤可明显增加家兔粪便以及结肠的含水量，改变粪便形状，提高通便效率，又不至于腹泻[16]，可作为临床治疗便秘的首选方剂。因此，这可能是增液承气汤可有效防治热结肠道型气分证的机制之一。

3.3增液承气汤对热结肠道型气分证大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量的影响

IL-1是急性期反应的主要诱导物，由抗原、内毒素病毒和细菌刺激诱导单核细胞产生的主要介质之一，可导致机体温度升高，关节痛，同时会引起中性粒细胞增多、血流动力学异常及某些抗肿瘤生理过程等[6]；IL-6是前炎症细胞因子，参与多种炎性疾病的病理生理过程；TNF-α由内毒素刺激单核巨噬细胞产生，可促进细胞生长、分化、凋亡及诱发炎症等，抑制宿主的免疫功能[17]。

本研究表明，大鼠处于热结肠道气分证候时，血清IL-1β、IL-6及TNF-α含量均显著高于对照组，即产生了炎性反应的趋势；预防性和治疗性给予增液承气汤均可有效降低热结肠道型气分证大鼠血清中IL-1β、IL-6及TNF-α含量，且IL-6含量与对照组无显著差异，治疗性给药与预防性给药疗效相当。由此可知，增液承气汤作为治疗热结肠道型气分证的经典方，可通过降低大鼠血清炎性细胞因子含量而达到防治功效。

研究表明，内毒素发热家兔血清中IL-1水平可出现显著升高，白虎汤仍可明显降低家兔血清中IL-1的水平，从而抑制体温升高[18]；用黄连配伍大承气汤可显著降低肠热腑实证大鼠血清IL-6水平，疗效明显优于单纯采取大承气汤，可更好地治疗肠热腑实证[19]；大黄具有凉血解毒、攻下泻火和荡涤肠胃功效，可降低发热大鼠血浆中TNF-α含量水平，发挥解热作用[20]。因此，增液承气汤作为治疗热结肠道型气分证的经典方，可在有效降低大鼠血清中炎性细胞因子含量，与大黄、白虎汤等降低热证模型动物血清中炎性细胞因子水平起到相似的疗效。

4结论

热结肠道型气分证大鼠的体温可出现升高，肠道IEL显著升高，GC数量显著下降，肠道组织可出现明显的炎性损伤，且血清炎性细胞因子含量显著升高；增液承气汤作为治疗热结肠道型气分证的经典方，当预防性或治疗性给予增液承气汤可降低十二指肠、空肠黏膜内IEL细胞数量，增加肠道黏膜内GC细胞数量，减轻肠道组织损伤程度，并有效降低大鼠血清中炎性细胞因子含量，由此达到防治热结肠道型气分证的目的。

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(编辑白永平)

Effects of Fluid-increasing Decoction for Purgation on Intestinal Structure，Concentration of IL-1β，IL-6 and TNF-α in serum of Rat in Heat Accumulation of Intestinal Type of Qi-fen Syndrome

WANG Zi-li1，2，WANG Xiao-qian1，ZHANG Zhu1，TU Jun-ping1，JIANG Hui-hui1，BIE Ying-tang2，ZHANG Jia-hua1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，SouthwestUniversity，Chongqing400715，China；2.ChongqingGondaGroupLtd.，Co.，Chongqing400020，China)

Abstract:In order to study the effects of fluid-increasing decoction for purgation on intestinal structure，concentration of IL-1β，IL-6 and TNF-α in serum of rat in heat accumulation of intestinal type of Qi-fen syndrome，the experiments were carried out to construct the heat accumulation of intestinal type of Qi-fen syndrome，and the fluid-increasing decoction for purgation was given to the rat in preventability or therapeutically，then body temperature，the intestinal organizational structure，and the concentration of inflammatory cytokines in serum of rat were also be studied.The results showed that the intestinal structure in rat in heat accumulation of intestinal type of Qi-fen syndrome were significantly changed，for example，the intestinal mucosa was dropped，inflammatory cells were infiltrated，IELs were increased，goblet cells (GC) were decreased，and the concentration of IL-1β，IL-6 and TNF-α in serum were increased in significantly.The rat were given with the fluid-increasing decoction for purgation in preventability，which will alleviate the damages to intestine of rats，and the concentration of IL-1β，IL-6 and TNF-α decreased significantly；and the rat were given the decoction in therapeutically，which will decrease the body temperature，keep the intestinal structure and mucosal barrier in normal，and decrease the concentration of IL-1β，IL-6 and TNF-α in serum of rats.Therefore，fluid-increasing decoction for purgation which is the classic formula to treat the rats in heat accumulation of intestinal type of Qi-fen syndrome has the preventability and therapeutically effects through decreasing the body temperature，maintaining the intestinal structure in normal，decreasing the IEL’ number and increasing the GC’ number，and then inhibition the secretion of inflammation cytokines.

Key words:fluid-increasing decoction for purgation；heat accumulation of intestinal type of Qi-fen syndrome；intestinal structure；inflammation cytokines

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.024

收稿日期：2015-7-13

基金项目：国家自然基金青年基金项目(31001082)；重庆市应用开发计划项目(cstc2014yykfB10001)；重庆市博士后科研项目特别资助项目(XM20120050)

作者简介：王自力(1979-)，男，四川成都人，副教授，博士，从事中药免疫药理学研究，Tel：023-68251196，E-mail: wzl9698@126.com

中图分类号：S853.9

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)04-0828-08