软骨损伤修复中骨髓间充质干细胞载体的选择

田林 罗荣宇 蓝崇 魏纪湖 戴子一

【摘 要】 查阅近年来公开发表的关于利用骨髓间充质干细胞及其载体治疗软骨损伤的相关文献资料，对常用载体的特征进行归纳。总结近阶段利用骨髓干细胞在治疗软骨损伤中各种载体的特点及其选择。综述骨髓间充质干细胞联合载体治疗软骨损伤的研究现状，重点对临床常用载体进行说明及展望。骨髓间充质干细胞作为一种多能干细胞为软骨损伤治疗提供了新的思路，而单纯干细胞移植难以达到应有的理想效果，临床中多采取骨髓间充质干细胞联合载体移植的方法。现有载体材料众多，各种材料特性不一、效果不同，如何整合利用各种材料的特点、避免其弊端，亟待解决和深入研究。

【关键词】 骨髓间充质干细胞；载体；软骨损伤修复

随着老龄化的加剧和疾病谱的变化，关节软骨损伤成为临床骨科常见疾病之一。软骨组织因无神经、无血管的解剖结构特征，缺乏自我修复和再生能力，损伤愈合困难；再加上缺损软骨处长期磨损，临床多演变为骨关节炎[1]。目前，临床治疗骨关节炎主要采用药物对症治疗，现有治疗手段中无论是关节镜下关节腔冲洗、骨髓刺激或自体软骨块移植均具有临床缺陷[2]。

近年来，随着组织工程的迅速发展，软骨损伤的修复与再生成为可能，并被认为是最具潜力的治疗方法[3]。在利用组织工程进行软骨修复时，种子细胞、支架材料、生长因子被认为是组织工程修复再生的三大主导因素。骨髓间充质干细胞（BMSCs）是一种具有多向分化潜能的均质性细胞，经特定条件诱导，可分化为多种间充质组织细胞[4]。在体外培养中，BMSCs可以保持稳定的多向分化潜能，且体内植入反应较弱，是一种理想的组织工程种子细胞[5]。单纯运用BMSCs疗软骨损伤难以体现其良好的生物学特性，达不到预期疗效。究其原因，单纯的细胞难以形成组织，而依赖联合支架材料或其复合物的骨髓干细胞联合体，不仅为细胞增殖分化提供了场所，还在组织再生中起到重要的引导作用，以达到控制组织或器官性状的目的[6-8]。

1 软骨损伤

关节软骨是一种无血管、少细胞的透明结缔组织，具有提供结构支撑和缓冲承重的作用，分为表层、中层、深层和钙化层。软骨组织的表层细胞呈扁平状，具有分泌表层蛋白多糖的作用；而呈垂直柱状排列的中层软骨细胞则具有表达二型胶原（Type n Collagen）、蛋白聚糖（Aggrecan）和其他蛋白的功能；在软骨细胞中数目最多的深层及钙化层细胞表达十型胶原（Type X collagen ）和碱性磷酸酶（ALP）[8]。

关节软骨受损的原因：①外伤性软骨受损，如在运动中膝关节软骨损伤；②创伤后的慢性损伤，如受伤后持续活动造成的劳损；③退行性的关节病变，软骨细胞是关节软骨中唯一能够产生丰富细胞外基质（ECM）的细胞，软骨组织一旦受损，软骨细胞就会表达炎症介质、基质降解酶和其他非正常蛋白质，形成成团聚集现象等病理组织学标志[9]。因为软骨组织的生理特征，所以关节软骨损伤后几乎无任何修复能力，组织破坏往往从关节表面持续延展到软骨深层，临床表现为关节性病变或骨关节炎。

2 BMSCs

BMSCs是一种具有多项分化潜能的细胞群，主要具有两大特性：①自我更新潜能。经多次传代仍可保持其原有的生物学特性，研究显示，BMSCs传代38次仍可保持其原有的生物学特性，其染色体核型和端粒酶活性并不随着多代培养而有所改变。②定向或多向分化潜能。BMSCs具有分化为骨细胞、软骨细胞、肝细胞和神经细胞等潜能[10]。

BMSCs能从胚胎干细胞中获得，也能够从成体组织中获得，如骨髓、脂肪组织、滑膜、胎盘和软骨膜等。较软骨细胞（hACs）、胚胎干细胞（ESCs）、诱导多能干细胞（iPSCs）等其他软骨损伤修复的种子材料[6-10]而言，BMSCs被认为是软骨修复中一种潜在的、运用最多的理想种子细胞。BMSCs修复关节软骨损伤的途径受到软骨损伤程度、载体等多方面因素的综合影响，其中载体类型是主要因素，并按这一因素将利用BMSCs修复软骨损伤的途径分为：①细胞—载体联合植入。将筛选的BMSCs在体外培养后与载体复合后植入软骨缺损平面。②关节软骨周围注射。将体外培养的BMSCs重悬于培养基或血清后直接注射入关节腔[11]。

BMSCs在软骨修复应用中的研究仍处于初期阶段。造成BMSCs在临床推进速度缓慢的原因有：①年长患者的种子细胞质量差，为保证移植成功率、避免排异反应，多采用自体种子细胞移植；但骨关节炎患者多为老年人，随着患者年龄增长，细胞增殖潜能受限，而如果选择异体干细胞移植，则要承担免疫反应的风险。②在种子细胞获取过程中，为了获得一定数量的细胞，需要延长细胞培养周期，而长时间的体外培养，可能改变BMSCs表型。

③新生软骨的力学强度较正常软骨弱[12]。

3 载体材料

软骨损伤修复再生的载体材料应具有促进BMSCs诱导成软骨和为细胞生长提供培养基的能力，具体筛选要求为：①为保证种子细胞获取营养以进行代谢，载体需具备通畅的孔隙通道；而影响通畅度的主要因素为孔隙大小及孔隙率。②与缺损区周围组织匹配和相容，并有良好的生物学强度以提供稳定的机械支撑，同时有利于细胞与缺损组织的黏附。③载体降解产物对机体无害，并尽量不产生排异反应。④便于消毒和消毒后保存。⑤为保持组织稳定度，载体降解率与缺损区组织再生率应保持动态平衡[13]。根据以上筛选条件，现有的可利用BMSCs载体包括自体骨、异体骨、有机材料、生物陶瓷、纳米材料、生物材料等。

3.1 软骨基质 来源于软骨基质的非细胞软骨片（ACSs）作为BMSCs的接种载体，构成BMSC-ACS复合体。Xue等[14]通过相关动物实验证实，经体外软骨基质培养后的BMSCs，在动物体内4周后，诱导性的BMSC-ACS复合体内有软骨形成，且比对照试验下的聚乙醇酸/聚乳酸（PGA/PLA）-BMSC复合体形成的软骨量更多。Yang等[15]证明软骨来源的细胞与BMSC构成载体具有良好的生物相容性，而良好的相容性是软骨再生的先决条件。软骨基质不可再生，材料紧缺是其运用中的主要限制因素。

3.2 自体骨 因自体骨不存在免疫反应且手术费用低，所以在临床中被广泛运用。自体骨不仅可以发挥良好的局部支撑作用，还因较佳的相容性使软骨再生时间极大缩短。在自体骨-BMSCs复合体移植手术中再加入相关的生长因子，干细胞可以黏附在松质骨内，以减少移植过程中干细胞的损失，具有愈合快、无排斥反应等优点，取得了较好的疗效。虽然髂骨、腓骨中上段都是自体骨的取材范围；但软骨缺损患者多为老年人，患者多并发骨质疏松，自体骨支撑力差[16]。

3.3 异体骨 异体骨包括同种异体骨及异种异体骨，常用的异体骨以脱钙骨基质为代表，并结合三维多孔结构使BMSCs容易增殖和分化，同时有利于营养成分渗透，取得了较好的临床效果。虽然临床一般经过脱钙、脱细胞、脱蛋白等不同方法降低抗原性，以改善组织相容性；但抗原性仍是其临床运用的主要弊端，亟待进一步解决。

3.4 天然纤维凝胶 天然生物材料作为支架材料在骨与软骨组织工程中被广泛运用，其种类繁多，应用广泛，天然材料具有无毒、组织相容性好、降解产物易完全吸收等优势。利用纤维凝胶的可塑性，可模拟机体的状态，为细胞提供稳定的空间环境，供细胞在其中附着、分化、增殖、并进行物质交换和生长代谢，诱导软骨组织形成，进行软骨缺损的修复。Jung等[17]发现天然纤维凝胶可促进BMSCs成软骨分化并能维持软骨细胞的表型，为软骨组织的稳定和再生提供可能，为BMSCs在软骨组织工程上的运用奠定基础。

3.5 人工合成材料

3.5.1 聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）支架 随着组织工程的发展，以聚乳酸、聚乙醇酸等为代表的新型人工材料被大量研制出来。以聚乳酸为例，作为聚乳酸3种异构体之一的聚左旋乳酸具有良好的组织相容性和可吸收性，大量研究证实BMSCs复合聚乳酸、聚乙醇酸聚合物是较理想的移植替代物。目前，在软骨修复中最常用的人工合成材料为聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）支架。PLGA具有良好的组织相容性、无毒性、易塑性强和降解速度可控性等优点，合适的强度足以支撑再生的软骨，良好的可塑性使其表面能做成大小合适的孔径，这些孔径是细胞增殖培养的良好三维空间[14]。

BMSCs联合PLGA支架修复软骨缺损中发现BMSCs会表达肥大软骨的相关基因，且因PLGA降解而产生的酸性环境可能对BMSCs产生副作用，从而影响软骨再生修复。

3.5.2 壳聚糖-β-甘油磷酸钠凝胶（Chitosan-disodium β glycerol phosphate，C/GP）支架 近来也有把C/GP作为载体的研究报告，Li等[18]通过相关动物实验证实：①在C/GP-BMSC联合体外培养的BMSCs呈成纤维细胞样形态，在成骨和成软骨诱导条件下可分别向成骨样细胞和软骨细胞分化；②BMSCs在C/GP凝胶内成活率达到90%以上；③体外培养21 d后，成软骨诱导的BMSCs在C/GP凝胶内产生大量软骨基质，故认为C/GP凝胶与BMSCs显示了良好的细胞相容性，有利于BMSCs在其内生长、增殖和成软骨分化，有望作为软骨组织工程的细胞载体得以推广。

3.5.3 生物陶瓷类 生物陶瓷类人工材料以碳酸钙、磷酸钙、硫酸钙及其各自的衍生物为代表，因生物陶瓷类材料具有较好的骨传导能力及骨诱导活性，被广泛运用为骨替代材料，其中磷酸钙及其衍生物是BMSCs领域运用最多的载体。磷酸钙的成分与骨基质的无机成分相似，与骨结合好。新型磷酸钙骨水泥，因其可降解性、成骨性及细胞相容性更佳，且可注射并具有缓释功能，近年被组织工程领域较多采用。章乐成等[13]研究证明，磷酸钙骨水泥的三维多孔结构表现出良好的细胞黏附与增殖性能，具有促进BMSCs向成骨细胞分化的作用，是优良的骨组织工程学的支架材料[19]。但Ng等[20]在实验中发现，虽然新型磷酸钙骨水泥作为一种可注射支架材料，其最大缺陷为生物力学强度的不足，这是今后组织工程学需要解决的新方向。

3.5.4 纳米级材料 纳米技术的应用为医药技术的发展提供了新的动力，用纳米技术将相关医学材料制备成纳米级材料，其改变的理化性质也将带来新的医学效果。

由于骨组织本身是一种纳米复合结构，其原理是在微米结构上模仿骨组织的结构及活性，在提高BMSCs及其载体相容性的基础上，更好地诱导和促进细胞的成骨作用[21]。纳米材料因其独特的组织结构、大小及形状，可以更好地与骨细胞及组织产生作用。Zandi等[22]研究表明，纳米羟基磷灰石具有较好的生物相容性、较高的生物活性及足够的机械支撑力量，适合BMSCs黏附、生长、增殖和分化。然而，纳米材料作为BMSCs载体，依然需要更多临床及实验研究深入探索其细胞毒性、生物相容性及生物降解能力。

4 小结与展望

综上所述，BMSCs作为一种具有巨大潜力的软骨修复再生的理想种子细胞，在临床应用中必须依托合适的载体，才能保证良好的软骨修复效果。在利用BMSCs治疗软骨损伤中，目前，可利用的BMSCs载体种类繁多，但无论固体材料、可注射材料还是经纳米技术改造后的载体材料均有各自缺陷。固体材料拥有足够的支撑力，却不能有效解决干细胞丢失的问题；可注射材料的可塑性强、吸附力好，但支撑力不足、力学性能偏低。目前比较前沿的是利用磁力引导对纳米级载体材料进行定向部署的靶向技术，该技术能很好地解决传统材料的缺陷，一旦有突破性进展，不失为软骨损伤修复的新途径。

BMSCs及其载体在软骨损伤修复中的研究与临床应用，还应结合其载体选择，在BMSCs的来源、分离、培养和移植方法等方面进一步研究。同时还应充分考虑患者临床条件及软骨损伤的类型、位置、面积大小；明确BMSCs及其载体在软骨损伤修复中的临床应用和疗效评估标准，使BMSCs及其载体修复软骨损伤更加系统化、科学化，最终获得理想的治疗效果和应用前景。

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收稿日期：2015-11-07；修回日期：2016-02-25