反相离子色谱法同时检测皮炎软膏中的6种水溶性维生素成分含量

叶翠平 谭兆平 区硕俊

摘 要：建立了反相离子色谱法同时测定皮炎软膏中6种水溶性维生素成分的分析方法。样品经提取净化后，用反相色谱柱梯度洗脱分离，二极管阵列检测器进行检测。在给定的浓度范围内各水溶性维生素成分的浓度与峰面积具有良好的线性关系，相关系数（r）在0.999 1～0.999 9之间。添加水平在0.5～200 mg/kg时回收率为86.0%～96.0%，相对标准偏差RSD（n=6）为3.60～7.45 %。方法检出限为0.30～0.50 mg/kg。该方法操作简便，准确度高，重现性好，是测定皮炎软膏中水溶性维生素成分的有效方法。

关 键 词：反相离子色谱；皮炎软膏；水溶性维生素；同时测定

中图分类号：TQ 463 文献标识码： A 文章编号： 1671-0460（2016）08-2050-04

Abstract： A reversed-phase ion chromatography method was established for determination of six water-soluble vitamins in dermatitis ointment. Samples were extracted and purified， and then they were tested by the reverse-phase high performance liquid chromatography instrument with diode array detector. All the compounds showed good linearity within the corresponding concentrations， with the correlation coefficient from 0.999 1 to 0.999 9. The recoveries of the method were from 86.0 to 96.0% with the RSD（n=6）values from 3.60% to 7.45% at the spiked levels from 0.50 mg/kg to 200 mg/kg. The detection limits of the method were from 0.30 mg/kg to 0.50 mg/kg. This method is convenient， accurate， and has good reproducibility and is suitable for determination of these water-soluble vitamins in dermatitis ointment.

Key words： reversed-phase ion chromatography； dermatitis ointment； water-soluble vitamins； simultaneous determination

维生素是维持机体代谢和生长所必需的一类低分子化合物的统称。在生物体内，其主要功能是通过作为辅酶的成分，调节机体代谢[1-3]。在水溶性维生素当中，B族维生素对于机体中的代谢尤为重要，缺乏时，可导致机体中氨基酸、糖原、脂肪和激素等代谢平衡遭到破坏，从而食欲不振、体重减轻、失眠、疲劳、記忆力和工作能力减退等症状，严重时甚至还会发生各种皮炎[4-8]。

对于治疗各种皮炎症状，B族维生素的直接接触对于治疗具有快速方便的特点。但近年来，医药产品问题层出不穷，为保障消费者的利益和人身安全，必须加大假冒伪劣产品的检测力度。目前，我国对水溶性维生素的检测标准步骤繁琐，维生素在提取过程中易分解，而微生物法和毛细管电泳法耗时耗力且重现性较差[9-11]。本实验建立了同时检测皮炎软膏中的6种水溶性维生素成分的高效液相色谱法，在优化条件下得到了良好的分离，并提高了结果的准确性，为检测药用产品中水溶性维生素的含量提供了参考方法。

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

皮炎软膏（广州市售）；盐酸、碘化钾、甲醇、丙酮、甲酸（分析纯，广州试剂厂）；戊烷磺酸钠（色谱纯，上海伊卡生物技术有限公司）；乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；水为超纯水；维生素B2（核黄素）、维生素B3（烟酸、烟酰胺）和维生素B6（盐酸吡哆醛、吡哆醇、盐酸吡哆胺）标准品（含量≥99%，国家标准物质中心）。

日本岛津LC-20A高效液相色谱仪，配有SPD-M20A二极管阵列检测器和LC-20AT四元泵。MS3 basic漩涡混合器（德国IKA公司）；D3024R冷冻高速台式离心机（美国赛洛捷克Scilogex公司）；CSR-1-200超纯化水机（北京爱思泰克科技开发有限责任公司）；

1.2 标准溶液及溶液的配制

烟酸、烟酰胺、吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺标准贮备液：分别准确称取标准品，用2 %甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，配制成100 mg/L的贮备液。

核黄素标准贮备液：准确称取标准品，用pH为3的盐酸溶液溶解并稀释至刻度，配制成100 mg/L的贮备液。

混合标准工作液：将上述6种水溶性维生素的标准贮备液按比例用水稀释，各浓度分别为0、0.5、2、5、10、20、50 mg/L。

流动相缓冲液：准确称取1.0 g戊烷磺酸钠，用pH为2.5的甲酸水溶液定容至1 L。经0.45 μm滤膜过滤待用。

1.3 样品的前处理

称取1.0 g样品于50 mL棕色具塞比色管中，加入约0.5 g碘化钾，再加入25 mL pH为3的盐酸溶液并振摇3 min后，然后加入5 mL丙酮振摇均匀后，用水定容至刻度处加盖摇匀。吸取约2 mL定容后溶液于离心管中，冷冻离心20 min（15 000 r/min，2 ℃），上清液用0.22 μm滤膜过滤，待测。

1.4 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Kinetex C18 （250 mm×4.6 mm×5 μm）；柱温：30 ℃；进样量：20 ?L；流量：1.0 mL/min；检测波长：200～390 nm；流动相：A乙腈、B缓冲液（表1）。

2 结果与分析

2.1 样品处理条件的选择

2.1.1 不同pH盐酸溶液对回收率的影响

由于核黄素与其它5种水溶性维生素性质差异较大，在常温下微溶于水，为了确保回收率，不能直接用纯水进行提取。而核黄素在酸性溶液下能体现出较强的稳定性，因此，选取了甲酸、盐酸和磷酸进行了对比实验。结果显示，核黄素在强酸性溶液中有较高的回收率，而且相比起甲酸和磷酸，盐酸具有更低的紫外吸收，对色谱图的影响最少。考虑到色谱柱的耐受程度，选取了pH为3的盐酸溶液作为提取液（图1）。

2.1.2 碘化钾对回收率的影响

由于水溶性维生素容易受光照、氧化等不同因素的破坏分解，所以在提取中加入适量的抗氧化剂有助于提高回收率。而由于采用了二极管阵列检测器，所以选择没有紫外吸收的盐作为抗氧化剂。二氧化硫及其衍生物由于对紫外光有吸收，所以不能选用焦亚硫酸钠和亚硫酸氢钠等作为抗氧化剂，以免影响分析。而亚硫酸钠虽然并没有紫外吸收，但由于浓度较大且体系中加入了盐酸，所以S=O双键会在276 nm处出现吸收[12]。综合考虑，最终选用了没有紫外吸收且还原性较好的碘化钾作为水溶性维生素的抗氧化剂。结果表明，碘化钾的加入对水溶性维生素的回收率有一定的提高（图2）。

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 缓冲液的选择

由于维生素B6电离能力较强，在反相色谱柱中保留能力低，因此需要在流动相中加入离子对试剂。从而增加样品离子在非极性固定相中的溶解度，使分离度增大，改善峰型。同时，因为维生素B6呈弱碱性，所以在色谱柱的承受范围内，用甲酸调节pH至2.5，使其能充分电离，从而有效地改善了峰型，提高了方法的灵敏度。

2.2.2 有机相的选择

本实验对比了甲醇和乙腈作为有机相对色谱图效果的影响。使用甲醇作为有机相时，虽然增加了化合物在色谱柱中的保留时间，但甲醇与水相混溶时，在梯度洗脱的条件下，产生的溶解热导致基线波动较大，影响分析。而乙腈虽然洗脱能力较甲醇大，但基线稳定，且能保持组分间有较好的分离度，故选用了乙腈作为有机相（图3）。

2.3 线性关系和检出限

將不同浓度的标准工作溶液在注入液相色谱进行测定，以浓度X（mg/L）为横坐标，相应的峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，相关系数r在0.9991～ 0.999 9之间，结果表明6种水溶性维生素的浓度和相应的峰面积呈良好的线性关系。以仪器的RS/N=3计算，分别测得6种水溶性维生素最低仪器检出限，再根据稀释倍数确定方法检出限，详细结果见表2。

2.4 回收率及精密度实验

用市售的皮炎软膏进行方法学实验，先测定其本底值，然后按照加标原则进行三个水平的添加，维生素B6的含量按照 GB 5413.13-2010将吡哆醛、吡哆胺折算为吡哆醇计算，最终测得平均回收率为86.0%～96.0%。对各加标水平进行平行测定6次，日内相对标准偏差（RSD）在3.60%～7.45%范围内，说明该方法重现性好，精密度高，达到分析要求（表3）。

3 结 论

本实验基于水溶性B族维生素的性质，采用了酸溶液提取法同时提取，并加入了碘化钾进行抗氧化，在不影响色谱图效果的前提下有效地提高了6种维生素组分的回收率。优化的色谱方法增加了维生素B6在色谱柱中的保留能力，有效地改善了峰型。6种维生素组分在30 min内有良好的分离度，且该方法灵敏度高，重现性好，操作简便，适用于软膏类产品中维生素B2、B3和B6的日常检验。

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