碱性体系下修饰纤维素酶米氏常数的测定

张勇

摘 要：用四种修饰纤维素酶Cell-MAL（5 ，10， 20 K）和Cell-SPA 5 K和天然纤维素酶在pH=13.63，T=45℃ 反应时间为1 h的7%（wt） NaOH/12%（wt） 尿素溶液中降解羧甲基纤维素。得到四种修饰纤维素酶的活性均比天然纤维素酶的活性高。其中Cell-MAL 5 K的活性最高。然后浓度分别为1/100、1/300、1/500和1/700的7%（wt）NaOH/12%（wt） 尿素水溶液中分别测定了天然纤维素酶和四种修饰纤维素酶的米氏常数分别为2.853、1.735、1.777、4.622和10.01 mg/L。

关 键 词：修饰纤维素酶； 催化活性； 最适条件； 米氏常数

中图分类号：TQ 028 文献标识码： A 文章编号： 1671-0460（2016）08-1690-04

Abstract： Four kinds of modified cellulases Cell-MAL（5K， 10 ， 20 K）and Cell-SPA 5 K and nature cellulase were used to degrade carboxymethyl cellulose under pH=13.63， T=45 ℃ reaction time of 1 h in 7%（wt） NaOH/12%（wt） urea solution， and the activity of obtained Cell-MAL 5 K was the highest. The Michaelis constants of four kinds of modified cellulases were measured in 7%（wt） NaOH/12%（wt） urea solution（1/100， 1/300， 1/500 and 1/700），and the results were as follows： the Michaelis constans of Cell-MAL（5 ， 10 ， 20 K）， Cell-SPA 5 K and native cellulase， were 2.853 mg/L， 1.735 mg/L， 1.777 mg/L， 4.622 mg/L and 10.01 mg/L， respectively.

Key words： modified cellulose； catalytic activity； optimal conditions； Michaelis constant（Km）

目前人类面临的主要挑战之一就是资源问题，其中纤维素资源是世界上存在最多的一种可再生的生物質资源[1]。因此，纤维素是解决粮食问题、能源问题和环境问题的最优资源。然而，纤维素本身的结构是一种高度结晶的结构，是由葡萄糖组成的大分子多糖，一般该物质不溶于水和一般的溶剂。因此限制了纤维素的有效利用[2]。纤维素酶降解纤维素是一种高效的途径来有效地利用纤维素资源。纤维素酶降解纤维素具有效率高、专一性强、反应条件温和等特点[3]。但是纤维素酶是一种蛋白质结构，存在酶活性低、价格昂贵、容易受外界环境影响等特点。为了更有效地利用纤维素资源，需要对纤维素酶进行化学修饰。大分子结合修饰[4]是目前应用最广泛的酶分子修饰方法，通过大分子结合修饰，天然纤维素酶的分子结构会发生某些变化，酶的特性和功能也有所改变，可以提高酶的催化效率，增加酶的稳定性，降低或消除酶的抗原性等众多优点。单甲氧基聚乙二醇类衍生物是常用的大分子修饰剂的一种，能与某一特定的氨基酸残基的侧链基团发生化学反应，形成共价键，用于改变酶的催化效率，增强蛋白质特别是酶在有机溶剂中的性能[5]。因此，本实验利用单甲氧基聚乙二醇类衍生物来修饰纤维素酶，不仅可以改变纤维素酶某些结构，还能提高纤维素酶的的活性[6]。通过修饰mPEG-MAL（5，10，20 K）和mPEG-SPA 5 K对纤维素进行化学修饰，得到了四种相对应的修饰纤维素酶[7]。用天然纤维素酶和四种修饰纤维素酶在碱性体系下分解降解羧甲基纤维素，结果发现，修饰纤维素酶的活性比天然纤维素酶的活性高出许多。然而，对修饰纤维素酶的动力学研究还未进行研究，为了更好的合理利用纤维素资源，本文章主要对修饰纤维素酶在7%（wt） NaOH/12%（wt）尿素的碱性体系下测定了各种修饰纤维素酶的米氏常数，为合理的开发和利用纤维素提供了有利的参考数据[8]。

1 实验部分

1.1 实验试剂

mPEG-MAL 5 K、mPEG-MAL 10 K、mPEG-

MAL 20 K、mPEG-SPA 5 K、天然纤维素酶，羧甲基纤维素，7%（wt） NaOH/12%（wt）尿素溶液，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。

1.2 试验方法

1.2.1 修饰纤维素酶的制备

将30 mL pH=7.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液加入到装有温度计、冷凝管和转子的50 mL三口烧瓶中，待温度达到35 ℃后，加入150 mg纤维素酶，慢速搅拌溶解，然后加入150 mg修饰剂（mPEG-SPA 5 K）和（mPEG-MAL 5 K、10 K、20 K） 混合均匀并计时，反应3 h，透析12 h，得到3 mg/mL修饰酶液（记为Cell-SPA 5 K和Cell-MAL 5、10、20 K）。

1.2.2 修饰纤维素酶在碱性体系下酶活力的测定

称取0.3g羧基纤维素加入到29.7 g加入到pH=13.63，T=45 ℃的7%（wt） NaOH/12%（wt）尿素水溶液中，待羧甲基纤维素完全溶解后，向溶液中分别加入10 mL的修饰纤维素酶液和天然纤维素酶液，反应1 h。反应结束后，采用DNS显色法[9]在540 nm处检测对应的吸光度A值，根据标准葡萄糖曲线[10]换算成相应的还原糖量，从而来比较修饰纤维素酶和天然纤维素酶的酶活性。

1.2.3 修饰纤维素酶米氏常数的测定

称取一定量的羧基纤维素加入到pH=13.63的7%（wt） NaOH/12%（wt）尿素溶液中，分别配制浓度为1/100、1/300、1/500和1/700的羧基纤维素溶液。称取30 g羧基纤维素溶液，加入10 mg酶液，45 ℃下反应，分别在4、8、12、16、20 min时采用DNS显色法在540 nm处检测对应吸光度A值，根据标准葡萄糖曲线换算成对应的还原糖量，然后作图得出不同底物下的反应初速度，最后用双倒数法[12]作图得到米氏常数。

2 结果与讨论

2.1 修饰纤维素酶的酶活力的测定

将修饰纤维素酶Cell-SPA 5 K、Cell-MAL（5、10、20 K）和天然纤维素酶在相同的体系下进行降解纤维素得到结果如图1所示：

由图1可知，经过修饰后的纤维素酶的活性天然纤维素酶的活性高，其中四种修饰纤维素酶中，Cell-MAL 5 K中的活性为最高。说明经过化学修饰的纤维素酶，在同样的反应条件下，其活性明显的高于天然纤维素酶的活性。这是因为高分子聚合物修饰剂与纤维素酶结合后，相当于在纤维素酶的活性中心周围形成了一种保护层，在反应的体系下，耐碱性和耐温性都会有所提高，因此酶的活性也会增加。

2.2 修饰纤维素酶米氏常数的测定

将修饰纤维素酶Cell-SPA 5 K、Cell-MAL （5 K、10 K、20 K）和天然纤维素酶在底物浓度为1/100的羧甲基纤维素溶液中进行降解纤维素，得到的数据如表1和图2所示：

将修饰纤维素酶Cell-SPA 5 K、Cell-MAL （5、10、20 K）和天然纤维素酶在底物浓度为1/300的羧甲基纤维素溶液中进行降解纤维素，得到的数据如表2和图3所示：

将修饰纤维素酶Cell-SPA 5 K、Cell-MAL （5、10、20 K）和天然纤维素酶在底物浓度为1/500的羧甲基纤维素溶液中进行降解纤维素，得到的数据如表3和图4所示：

将修饰纤维素酶Cell-SPA 5 K、Cell-MAL （5、10、20 K）和天然纤维素酶在底物浓度为1/700的羧甲基纤维素溶液中进行降解纤维素，得到的数据如表4和图5所示：

根据修饰纤维素酶Cell-SPA 5 K、Cell-MAL （5、10、20 K）和天然纤维素酶在不同浓度的底物下降解纤维素所得到的反应速度如表5和图6所示：

求的四种修饰纤维素酶和天然纤维素酶的米氏常数分别为2.853、1.735、1.777、4.622和10.01 mg/L。

3 结 论

四种修饰纤维素酶Cell-SPA 5 K、Cell-MAL （5、10、20 K）和天然纤维素酶在pH=13.63，T=45℃ 反应时间为1H的7%（wt）NaOH/12%（wt）尿素溶液中进行降解羧甲基纤维素，结果表明经过化学修饰后的纤维素酶的活性明显高于天然纤维素酶的活性。原因是化学修饰剂的导入导致了纤维素酶的空间结构构象发生了改變，从而导致了酶对底物的亲和力下降，使修饰酶需要更高的底物浓度才能达到修饰酶的最大反应速度。并在不同的底物浓度下测定了5种修饰纤维素酶的米氏常数分别为2.853、1.735、1.777、4.622和10.01 mg/L。结果表明天然纤维素酶的米氏常数高于米氏常数。米氏常数越小，说明酶与底物之间的亲和力越大，即酶的活性越高。

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