三子养亲汤对支气管哮喘模型大鼠保护作用及对CysLTs炎症通路的影响

徐升，董艳，杨昆，龚新月，李娜

(1.成都中医药大学临床医学院 中医内科，四川 成都 610032；2.四川省中医医院 呼吸科，四川 成都 610071)

三子养亲汤对支气管哮喘模型大鼠保护作用及对CysLTs炎症通路的影响

徐升1，董艳2Δ，杨昆1，龚新月1，李娜1

(1.成都中医药大学临床医学院 中医内科，四川 成都 610032；2.四川省中医医院 呼吸科，四川 成都 610071)

目的 探讨三子养亲汤对支气管哮喘模型大鼠保护作用及对半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes，CysLTs)炎症通路的影响。方法 将60只Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型组、孟鲁司特组、三子养亲汤2.7、5.4和10.8 g/kg剂量组，每组10只。除正常组外，其他各组动物经10%卵白蛋白(ovalbumin，OVA)腹腔注射致敏和 1%气道吸入激发建立哮喘模型。正常组使用等量0.9%NaCl致敏和治疗。使用光学显微镜观察各组肺组织，使用ELISA试剂盒检测各组大鼠血清中的白细胞介素-5(IL-5)和CysLTs水平，使用Western blot检测各组大鼠肺组织中CysLTs受体和嗜酸性粒细胞趋化因子-3(eotaxin 3，Eot-3)蛋白表达水平，使用逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)检测各组大鼠肺组织中CysLTs受体和Eot-3的mRNA表达量。结果 与模型组比较，孟鲁司特组和三子养亲汤10.8 g/kg剂量组的肺组织病理显著改善。三子养亲汤10.8、5.4 g/kg剂量组血清IL-5、CysLTs水平显著低于模型组(P<0.05)，三子养亲汤10.8、5.4 g/kg剂量组肺组织中的CysLTs受体和Eot-3 mRNA及2.7 g/kg剂量组Eot-3 mRNA表达水平显著低于模型组(P<0.05)，三子养亲汤2.7、5.4和10.8 g/kg剂量组肺组织中的CysLTs受体和Eot-3蛋白表达水平显著低于模型组(P<0.05)。结论 三子养亲汤对支气管哮喘模型大鼠具有保护作用，而保护作用的机制可能是通过阻断CysLTs介导的炎症通路。

三子养亲汤；孟鲁司特；支气管哮喘；CysLTs；动物模型

支气管哮喘是一种由淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞等多种炎性细胞和炎性介质所介导的呼吸道慢性炎性疾病[1]。中医认为内伏痰湿是支气管哮喘发生的根本原因[2]。目前临床上已有多种药物通过抑制半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes，CysLTs)的受体来阻断CysLTs炎症通路治疗支气管哮喘时收到良好的治疗效果[3]。三子养亲汤出自明代《韩氏医通》，具有降气消食、温化痰饮之功效。三子养亲汤以消为补，从化痰的角度来改善哮喘症状，在临床上对支气管哮喘的治疗收到了良好的治疗效果[4]。但三子养亲汤治疗支气管哮喘的作用机制还不明确，缺乏客观的实验结果。这为三子养亲汤在治疗支气管哮喘的广泛应用造成一定的阻碍，本研究采用支气管哮喘大鼠模型，通过检测给药三子养亲汤后支气管模型大鼠体内相关因子的变化，以客观阐释三子养亲汤对支气管哮喘治疗作用的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药物：三子养亲汤(白芥子9 g、紫苏子9 g和莱菔子9 g，所购中药由本院董艳博士鉴定为真品，所购三味中药在温水中浸润30 min，然后加2倍药材量的温水先大火至水沸腾，后文火煎煮10～15 min)；孟鲁司特(四川大冢制药有限公司，产品批号为20140908)。

1.1.2 实验动物：选择健康的Wistar大鼠60只，雄性，体质量为230～260 g周龄为8～9周，购自成都中医药大学实验动物中心[许可证号为SCXK(川)：2011-21]，本研究通过成都中医药大学伦理委员会审核，并在整合实验过程中遵守《动物保护法》相关规定。

1.1.3 试剂：CysLTs兔抗鼠多克隆抗体(美国Sigma公司，产品批号为14234)，Eot-3兔抗鼠多克隆抗体(美国Sigma公司，产品批号为14854)，氢氧化铝(河南万丰海科材料有限公司，产品批号为20131211)，二抗为兔抗(美国Sigma公司，产品批号为14551)，IL-5 ELISA试剂盒(美国Sigma公司，产品批号为14361)和CysLTs(美国Sigma公司，产品批号为14364)，兔抗ECL发光试剂(上海谱振生物科技有限公司，产品批号为20150302)，总蛋白提取试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，产品批号为20150609),戊巴比妥钠注射剂(上海新亚药业有限公司，产品批号为：20151008)，PCR试剂盒(美国Thermo Fisher公司，批号为205673)。

1.1.4 仪器：442型超声雾化器(上海合力医疗器械厂)，H-7650型透射电子显微镜(日本日立公司)，CT16E型低温离心机(日本日立公司)、plex 200型电泳仪(Bio-Rad公司)，EXL-808型酶标仪(美国宝特公司)，2720型PCR仪(美国Thermo Fisher公司)。

1.2 方法 将60只大鼠随机分为正常对照组、模型组、孟鲁司特组、三子养亲汤10.8、5.4和2.7 g/kg剂量组，每组10只。

1.2.1 动物模型复制及给药：模型组、孟鲁司特组和三子养亲汤各剂量组大鼠在实验第1天和第8天分别腹腔注射，对大鼠的支气管进行致敏，其中1 mL注射液中含100 mg的OVA和100 mg氢氧化铝凝胶的无菌抗原液；再从实验第14天后将模型组、孟鲁司特组和三子养亲汤组大鼠置于密闭的玻璃容器中，使用超声雾化器将1%OVA水溶液雾化吸入激发，每天1次，每次30 min，连续激发14 d。正常对照组大鼠使用等量0.9%NaCl进行腹腔内注射以及雾化吸入，操作方法同上[5]。各组大鼠在实验第1天开始灌胃给药，正常对照组(0.9%NaCl)、模型组(0.9%NaCl)、孟鲁司特组[0.004 g/(kg·d)]、三子养亲汤各剂量组(10.8、5.4和2.7 g生药/kg)，灌胃体积为1 mL/100 g，各组大鼠在每次激发前1 h给药，连续14 d。

1.2.2 指标检测:

① 肺组织HE及电镜观察：取各组大鼠的部分肺组织经过0.9%NaCl清洗后放置于10%甲醛溶液中固定，取经过10%甲醛固定肺组织1 mm3，然后经过脱水、包埋和切片后分别进行HE染色和3%的醋酸铀-枸橼酸铅染色，再分别对肺组织切片采用光学显微镜进行观察。

② 大鼠血清中IL-5和CysLTs水平检测：各组大鼠在最后一次激发24 h后按0.3 mL/100 g腹腔注射2.0%的戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血5 mL，静置，待血清和血细胞分层后用离心机分离，3000 r/min，离心10 min，收集血清，按照IL-5 ELISA试剂盒和CysLTs试剂盒上的使用说明对各组大鼠血清中的IL-5和CysLTs水平检测。

③ 大鼠肺组织中CysLTs受体和嗜酸性粒细胞趋化因子-3(eotaxin 3，Eot-3)的mRNA表达水平检测：取各组大鼠的部分肺组织经过0.9%NaCl清洗后，按照RNA提取试剂和操作说明提取各组大鼠肺组织中的RNA。CysLTs受体的上游引物为：5’-CTTGAACGTACTCTGACACTACAA-3’，下游引物为：5’-GAGATGT-CGTCAGATTTTCAGTTCCAT-3’；Eot-3的上游引物为：5’-GGAACT-GCCACACGTGGGAGTGAC-3’，下游引物为：5’-CTCTGGGAG-GAAACACCCTCTCC-3’；β-actin的上游引物为：5’-TCCTGTGGC-ATCCACGAAACT-3’，下游引物为5’-GAAGCATTTGCGGTGGAT-3’。参照逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)操作说明检测各组大鼠肺组织中的CysLTs受体和Eot-3的mRNA表达水平。

④大鼠肺组织中CysLTs受体和Eot-3表达水平检测：在最后一次激发24 h后，取各组大鼠的1/3肺组织经过0.9%NaCl清洗后，提取总蛋白，总蛋白用凝胶电泳仪对分离，转膜，封闭，加入稀释6000倍CysLTs受体和700倍Eot-3兔抗鼠多克隆抗体并在4 ℃的条件性孵育过夜，再加稀释6000倍二抗常温下孵育2 h，涂抹ECL发光试剂，暗室内曝光，拍照，用Image J软件分析目的蛋白和内参蛋白β-actin的灰度值并进行统计。

2 结果

2.1 三子养亲汤对支气管哮喘大鼠肺组织病理的影响 正常对照组支气管壁及其周围肺组织结构完整；模型组大鼠肺组织中可以见到大量的炎性细胞，支气管黏膜出现水肿，支气管内的分泌物增多，支气管壁厚度增加，管腔直径变小，可以见到少数的支气管内部的褶皱减少，并且伴有部分上皮出现脱落，支气管壁及其周围可以见到炎性细胞浸润，其中浸润较多的是EOS细胞；孟鲁司特组和三子养亲汤10.8 g/kg剂量组肺泡内仅可以见到少量的炎性细胞，部分支气管黏膜仅出现程度较轻的水肿，支气管壁及其周围炎性细胞浸润较少；三子养亲汤5.4 g/kg剂量组和2.7 g/kg剂量组炎性细胞浸润程度及支气管黏膜水肿程度在模型组和三子养亲汤10.8 g/kg剂量组之间。

2.2 三子养亲汤对支气管哮喘大鼠血清中IL-5和CysLTs水平的影响 模型组血清中的IL-5和CysLTs水平显著高于正常对照组，孟鲁司特组以及三子养亲汤10.8、5.4 g/kg剂量组血清中的IL-5和CysLTs水平显著低于模型组(P<0.05)。见表1。

表1 三子养亲汤对支气管哮喘大鼠血清中IL-5和CysLTs水平的影响

*P<0.05，与正常对照组比较，compared with normal control group；#P<0.05，与模型组比较，compared with model group

2.3 三子养亲汤对支气管哮喘大鼠肺组织中的CysLTs受体和Eot-3的mRNA表达的影响 模型组大鼠肺组织中的CysLTs受体和Eot-3的mRNA水平显著高于正常对照组；孟鲁司特组以及三子养亲汤10.8、5.4 g/kg剂量组肺组织CysLTs受体和Eot-3的mRNA水平显著低于模型组，三子养亲汤2.7 g/kg剂量组肺组织Eot-3mRNA显著低于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 三子养亲汤对支气管哮喘大鼠肺组织中的CysLTs受体和Eot-3的mRNA表达的影响

*P<0.05，与正常对照组比较，compared with normal control group；#P<0.05，与模型组比较，compared with model group

2.4 三子养亲汤对支气管哮喘大鼠肺组织中的CysLTs受体和Eot-3蛋白表达的影响 模型组大鼠肺组织中的CysLTs受体和Eot-3蛋白表达水平显著高于正常对照组，孟鲁司特组以及三子养亲汤2.7、10.8、5.4 g/kg剂量组肺组显著的低于模型组(P<0.05)。见表3。

表3 三子养亲汤对支气管哮喘大鼠肺组织中的CysLTs受体和Eot-3表达的影响

*P<0.05，与正常对照组比较，compared with normal control group；#P<0.05，与模型组比较，compared with model group

3 讨论

支气管哮喘在中医中属于哮喘的范畴，临床治疗中，哮喘发病以祛寒化饮、温肺止哮为重要治疗原则[5-7]。三子养亲汤是由白芥子、紫苏子和莱菔子三味药组成，方中的白芥子具有温肺利气、快膈消痰之功效，紫苏子具有降气行痰、止咳平喘之功效，莱菔子具有消食导滞、行气祛痰之功效，三味药物合用具有顺气消痰、消化食积、止咳平喘之功效[8]。三子养亲汤在临床中广泛的应用于支气管炎、支气管哮喘等呼吸系统疾病[9]，近些年来的药理学研究结果同样表明三子养亲汤具有抗炎、止咳、平喘、祛痰的药理作用[10]。在本研究中三子养亲汤对支气管哮喘大鼠肺组织病理观察结果表明，三子养亲汤对支气管哮喘大鼠肺组织具有保护作用，降低支气管哮喘大鼠肺组织中EOS细胞浸润，降低炎性反应等。

支气管哮喘是一种由多种炎性细胞、炎性因子以及细胞因子共同作用的结果，发病机制十分复杂。但白三烯是导致支气管哮喘发生的一种非常重要的炎性介质，已经在多项研究结果中表明CysLTs介导的炎症通路在支气管哮喘的发生和发展的过程中起到非常重要的作用[11]。而抑制CysLTs介导的炎症通路成为治疗支气管哮喘药物非常重要一个作用靶点，如在临床中使用较多的孟鲁司特即是通过抑制CysLTs介导的炎症通路来治疗支气管哮喘[12]。CysLTs和CysLTs受体相互结合后可以促进Eot-3细胞活性因子的表达，而Eot-3对Eos细胞具有特异性的趋化作用，并且Eot-3是促进Eos细胞趋化作用最强的活性因子[13]。在本研究中模型组支气管哮喘大鼠血清中的IL-5和CysLTs以及肺组织中的CysLTs受体和Eot-3蛋白表达水平和肺组织中的CysLTs受体和Eot-3的mRNA表达水平显著高于正常对照组，而三子养亲汤高、中剂量组血清IL-5和CysLTs水平显著低于模型组，三子养亲汤高、中剂量组肺组织中的CysLTs受体和Eot-3的mRNA及低剂量组Eot-3的mRNA表达水平显著低于模型组，三子养亲汤高、中、低剂量组肺组织中的CysLTs受体和Eot-3蛋白表达水平显著低于模型组(P<0.05)，这些结果表明阻断CysLTs介导的炎症通路是三子养亲汤对支气管哮喘大鼠保护可能的一个作用机制之一。

综上所述，三子养亲汤对支气管哮喘模型大鼠具有保护作用，而保护作用的机制可能是通过阻断CysLTs介导的炎症通路。这一研究结果为客观地解释三子养亲汤治疗支气管哮喘的作用机制提供了实验依据。

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(编校：王俨俨)

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Protective effect of Sanzi-Yangqin Decoction on asthmatic rats and the influence of Sanzi-Yangqin Decoction on CysLTs inflammatory pathways

XU Sheng1, DONG Yan2Δ, YANG Kun1, GONG Xin-yue1, LI Na1

(1.Department of Chinese Internal Medicine, College of Clinical Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610032, China; 2.Department of Respiratory Medicine, Sichuan Chinese Medicine Hospital, Chengdu 610071, China)

ObjectiveTo explore the protective effect of Sanzi-Yangqin Decoction on asthmatic rats and the influence of Sanzi-Yangqin Decoction on cysteinyl leukotrienes (CysLTs) inflammatory pathways.MethodsThe 60 Wistar rats were randomly divided into normal control group, model group, montelukast group, Sanzi-Yangqin Decoction 2.7 g/kg dose group, 5.4 g/kg dose group and 10.8 g/kg dose group, 10 rats in each group.In addition to the normal group, the other groups of animals

10% ovalbumin (OVA) by intraperitoneal injection and 1% airway inhalation challenge to establish asthma model.Normal control group received saline sensitization and treatment.The lung tissue was observed by optical microscopy.The serum levels of IL-5 and CysLTs were detected by ELISA.The levels of CysLTs receptor and Eot-3 protein in rat lung tissue were detected by Western blot.The CysLTs receptor and Eot-3 mRNA levels in rat lung tissue were detected by reverse transcription PCR (RT-PCR).ResultsCompared with the model group, lung tissue pathology significantly improved in montelukast group and Sanzi-Yangqin Decoction 10.8 g/kg dose group.The serum levels of IL-5 and CysLTs in Sanzi-Yangqin Decoction 10.8 and 5.4 g/kg dose group were lower than model group (P<0.05).The levels of CysLTs receptor and Eot-3 mRNA in 10.8 and 5.4 g/kg dose group, Eot-3 mRNA in 2.7 g/kg dose group in rat lung tissue were lower than model group (P<0.05).The levels of CysLTs receptor and Eot-3 protein of 2.7, 5.4 and 10.8 g/kg dose group in rat lung tissue were lower than model group (P<0.05).ConclusionSanzi-Yangqin Decoction has a protective effect for asthmatic rats.The mechanism of the protective effect may block CysLTs mediate inflammatory pathways.

Sanzi-Yangqin Decoction; montelukast; bronchial asthma; CysLTs; animal model

四川省科技厅课题(2014SZ0071-2)

徐升，男，博士在读，研究方向：呼吸病与老年病的实验与临床研究，E-mail:269021239@qq.com；董艳，通信作者，女，博士，研究方向：呼吸病与老年病的实验与临床研究，E-mail：1006071854@qq.com。

R562.2+5

A

1005-1678(2016)01-0040-04