猪传染性胃肠炎病毒分子生物学检测方法研究进展

朱密

摘 要：该文介绍了猪传染性胃肠炎病毒基因组织结构和基因表达方式，并分析了各功能蛋白的主要功能，最后分别介绍了核酸探针、普通RT-PCR方法、多重RT-PCR方法、套式PCR、荧光定量RT-PCR方法、环介导等温扩增技术等分子生物学检测方法在猪传染性胃肠炎病毒检测中的应用。

关键词：猪传染性胃肠炎；病毒分子；生物学检测方法

中图分类号 S858.28 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）12- 0110-02

猪传染性胃肠炎（TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）导致猪出现脱水、水样腹泻以及呕吐等为主要临床症状的高度传染性疾病，该病在春季、初秋以及冬季具有较高的发病率[1]。猪传染性胃肠炎最早发生于美国，随后在世界各地均有发生，我国于20世纪50年代首次发现该病，目前全国大部分地区均发生过猪传染性胃肠炎。不同日龄和品种的猪均可以感染传染性胃肠炎，其中以15日龄左右的仔猪发病后死亡率最高，高达100%；5周龄以上的仔猪感染传染性胃肠炎后死亡率较低，但是会影响仔猪后期的生长，降低仔猪的饲料利用率。目前，该病已被世界动物卫生组织列为B类必检传染性疾病。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，该技术已经广泛用于各种细菌性和病毒性疾病的检测[2]。本文综述了分子生物学技术在传染性胃肠炎中的应用，以期能为从事传染性胃肠炎诊断和防控的工作者提供帮助。

1 传染性胃肠炎病毒基因组结构和基因表达方式

1.1 TGEV基因组结构 传染性胃肠炎病毒属于冠状病毒科冠状病毒属，该病毒的基因组不分节段、单股正股RNA，具有高度传染性。传染性胃肠炎基因组全序列分为7个区29kb，结构序列为5'-la-lb-S-3a-3b-sM-M-N-7-3'，并且该基因组的3'-末端以共价键结合的poly结构，5'末端有帽结构[3]。基因组1约有20kb，主要负责病毒的编码，其余基因均在近3'端。传染性胃肠炎病毒全基因组编码由4种结构蛋白和3种非结构蛋白组成，其中基因7、基因3和基因1为非结构蛋白，N、M、sM、S为传染性胃肠炎的结构蛋白。

1.2 基因表达方式 传染性胃肠炎病毒在胞浆脱壳以后，其正链RNA就呈现了mRNA的功能，使基因1转录表达RNA聚合酶，同时该基因有作为模板合成负链RNA，进而亲代RNA与负链RNA形成双链复制中间体。因此，在感染传染性胃肠炎病毒的细胞内，可以检测出不完全RNA、基因组RNA、mRNA以及双链中间体4个特异性RNA，这可以作为猪传染性胃肠炎病毒分子生物学检测指标之一[4]。

2 结构蛋白及功能

猪传染性胃肠炎病毒的结构蛋白主要为S糖蛋白、M蛋白、N蛋白以及sM蛋白等。S蛋白是猪传染性胃肠炎病毒纤突的主要成分之一，在病毒粒子的表面，该蛋白基因全长4.3kb，蛋白分子量为195～220ku；S蛋白不仅是决定猪传染性胃肠炎病毒抗原的重要结构，也影响着病毒对细胞的致病性、亲嗜性等。M蛋白是构成病毒粒子蛋白的主要有效成分之一，研究表明[5]，M蛋白前体是由膜外区、信号肽、极性区、跨膜区突于病毒粒子内C-端区等功能区域构成，分子质量为29～31ku；M蛋白不仅决定了病毒粒子的出芽位点和装配位点，也可以影响病毒变异。N蛋白是一种酸性蛋白质，分子量为47KDa，含有382个氨基酸残基，该蛋白不仅是猪传染性胃肠炎病毒的结构蛋白，同时对病毒基因组的加工、复制都具有重要作用。sM蛋白分子质量为78ku，含有1种小膜蛋白和82个氨基酸残基，该功能蛋白在抗猪传染性胃肠炎病毒感染的体液和细胞免疫中具有重要作用。

3 分子生物学检测方法

3.1 核酸探针 核酸探针检测方法的基本原理是利用核苷酸碱基互补，在碱基互补过程中，采用标记物标记与被检测靶序列互补的单链核酸分子，进而检测到目的核序列。该检测方法与扫描电镜、荧光抗体试验、病毒分离等相比，具有较好的特异性，并且可以实现快速检测的目的。现代研究表明[6]，不同的病毒探针可以分别扩增出与其对应的病毒模板，对其他病毒模板影响不大，同时核酸探针扩增的最低检测限为3 000～6 000个拷贝的单个病毒核酸，具有较高的特异性和敏感性。

3.2 普通RT-PCR方法 该检测方法使用的首要条件是知道被检测病原的相关目的基因序列，根据相关目的序列后，采用相关软件设计相应的引物，然后进行体外扩增目的基因，进而达到检测的目的。王黎等[7]采用RT-PCR方法检测猪传染性胃肠炎病毒，并采用相同浓度做重复性检测，结果显示RT-PCR扩增的特异性条带为590bp左右；然后又以猪瘟病毒、猪细小病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒以及猪轮状病毒做特异性试验，结果显示仅有猪传染性胃肠炎病毒得到了特异性目的条带，所以RT-PCR检测方法对猪传染性胃肠炎病毒检测具有较好的重复性和特异性。

3.3 多重RT-PCR方法 多重RT-PCR检测方法是以普通PCR为基础发展的一种新型检测方法，该检测方法可以在一个PCR反应体系中加入多对引物，并通过采用优化后的PCR反应条件，达到同时检测多种病原的目的，具有快速、成本低等优点，目前也常用于各种疾病的诊断。霍金耀等[8]建立了多重RT-PCR法检测传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、嵴病毒和A群轮状病毒的方法，并对该检测方法进行了敏感性试验和特异性试验，结果显示，多重RT-PCR法可以检测出50TCID50的混合病毒，且能扩增出长度为275bp、544bp、750bp的3条特异性片段，具有较高的特异性和敏感性，可以在临床上推广使用。

3.4 套式PCR方法 套式PCR方法需要设计内、外2对引物，并通过2次扩增对样品进行检测，该方法相对其他PCR检测方法，具有较高的敏感性，且节约成本。现代研究表明，PCR技术在检测病毒时，可以省略不同病毒分离的过程，具有较高的敏感性和特异性，而套式PCR方法在病毒粒子较少的情况下依然能够检测出，表明套式PCR比常规PCR具有更好的敏感性。沈海娥等[9]采用套式PCR检测猪呼吸道冠状病毒和猪传染性胃肠炎病毒的S基因序列，根据两组病毒的基因序列分别设计了2对引物，然后分别以猪呼吸道冠状病毒细胞和猪传染性胃肠炎病毒细胞为模板进行套式PCR特异性片段扩增，结果显示，猪呼吸道冠状病毒扩增的基因片段为214bp，猪传染性胃肠炎病毒扩增的基因片段为886bp，同时检测出了这种病毒，具有较高的特异性和敏感性。

3.5 荧光定量RT-PCR方法 荧光定量RT-PCR检测方法的原理是在PCR反应体系中采用荧光探针标记法或加入了SYBR GreenI荧光染料标记PCR的反应产物，然后使用反应仪器收集反应产物的荧光信号，并根据荧光信号的强弱确定产物的量，进而达到与起始模板准确定量的目的。该检测方法与常规RT-PCR相比，不需要进行电泳试验检测PCR反应产物，反应结果更为直观、方便，同时又避免了因电泳试验对环境造成污染。王建中等[10]根据猪传染性胃肠炎病病毒的S基因序列设计了引物，并通过多组试验对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化，结果显示，优化后的检测方法对其他病原的检测结果均为阴性，检测结果的敏感性高达43.07拷贝/μL，是常规PCR检测方法的100倍，具有较高的敏感性和特异性。

3.6 环介导等温扩增技术 环介导等温扩增技术是近几年新兴的一种分子生物学检测方法，因其具有特异性强、敏感性高、检测速度以及操作简单等优点，目前已经广泛应用于病毒病和细菌病检测。高睿泽等[11]根据猪传染性胃肠炎病毒的N基因建立了环介导等温扩增快速检测方法，并对该检测方法的敏感性和特异性进行了评价，结果显示，该方法在63℃下可以使猪传染性胃肠炎病毒N基因获得较高的特异性扩增，且与猪流行性腹泻病毒等物交叉反应，具有加高的特异性；同时该检测方法可以检测到131.4fg/μL的DNA，其灵敏度比常规PCR高出3个数量级。

参考文献

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[2]刘邓，袁秀芳，徐丽华，等.猪传染性胃肠炎诊断技术研究进展[J].动物医学进展，2008，29（12）：64-68.

[3]霍芳，宋道祯，汤少伟，等.猪传染性胃肠炎病毒诊断技术研究进展[J].饲料与畜牧·规模养猪，2014，（2）：30-33.

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[6]陈伯祥，杨明，郭慧琳，等.猪传染性胃肠炎间接ELISA检测方法建立[J].中国农业信息（上半月），2012，（1）：167-168.

[7]王黎，李碧，周远成，等.猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立及临床应用[J].中国兽医学报，2015，35（2）：190-194.

[8]霍金耀，郑逢梅，陈陆，等.猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、A群轮状病毒和嵴病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用[J].中国兽医学报，2013，33（12）：1792-1797.

[9]沈海娥，郭福生，龚振华，等.应用套式PCR检测和区分猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒的试验[J].中国动物检疫，2003，20（7）：21-23.

[10]王建中.猪传染性胃肠炎病毒S基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J].中国畜牧兽医，2014，41（1）：66-71.

[11]高睿泽，白云云，李训良，等.猪传染性胃肠炎病毒RT-LAMP检测方法的建立及应用[J].中国兽医科学，2015，5（6）：572-577.

（责编：张宏民）