电针对睡眠剥夺大鼠行为学和脾脏IL- 1β、IL- 6和TNF-α的影响

胡天俊，虞 洁，王秀莲，何扬子（.暨南大学，广州 50630；.暨南大学附属第一医院，广州 50630）



电针对睡眠剥夺大鼠行为学和脾脏IL- 1β、IL- 6和TNF-α的影响

胡天俊1，虞 洁1，王秀莲1，何扬子2
（1.暨南大学，广州 510630；2.暨南大学附属第一医院，广州 510630）

摘要：［目的］观察电针对睡眠剥夺大鼠行为学和脾脏白细胞介素（IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA表达的影响。［方法］将32只Wistar雄性大鼠随机分为空白对照组、模型组、安定组和电针组。对照组未做任何处理，其余3组给予注射氯苯丙氨酸（PCPA）睡眠剥夺后，安定组给予腹腔注射安定，电针组给予电针百会、神庭，每组每日治疗1次，连续5 d后行旷场实验并采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测大鼠脾脏IL-1β、IL-6和TNF-α。［结果］与对照组相比，模型组大鼠旷场实验水平得分、垂直得分和中央格停留时间明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，安定组和电针组旷场实验水平得分、垂直得分和中央格停留时间明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与对照组相比，模型组IL-1β和TNF-α含量显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.01），IL-6无统计学差异（P＞0.05）；与模型组相比，安定组和电针组IL-1β和TNF-α含量显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），IL-6无统计学差异（P＞0.05）。［结论］电针百会、神庭既能明显改善睡眠剥夺症状，又能很好控制IL-1β、IL-6和TNF-α的表达，解除失眠对机体的损害。

关键词：电针；睡眠剥夺；细胞因子

失眠是指睡眠的始发和睡眠的维持发生障碍，是一类睡眠数量或质量都达不到正常需求的主观体验。历代中医家又称之为“不得卧”、“少寐”等，是由于心神失养或不安而引起的，临床上针灸对失眠有较好的疗效，但其具体治疗机制还不太清楚。失眠可导致人的工作能力、认知功能及情绪下降［1］，甚至可影响自主神经系统、内分泌系统和免疫功能，诱发多种心身疾病，严重者可导致死亡［2］。许多疾病，如感染、纤维肌瘤、恶性肿瘤、抑郁症等均与睡眠剥夺有关［3］。失眠已成为广泛和突出的医学和社会问题。因此，研究针灸治疗失眠具有重要意义。笔者拟从脾脏IL-1β，IL-6和TNF-α探讨电针的治疗机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 SPF级Wistar雄性大鼠32只，体质量（200±20）g，6～8周龄，由南方医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK＜粤＞2011-0015，批号：44002100004077。饲养于暨南大学动物实验管理中心SPF级动物房。按照随机数字表法随机分为空白对照组、模型组、安定组和电针组，每组8只，正常隔离饲养1周后进行干预处理。实验在安静、通风、室温适宜的条件下进行。

1.2 模型制备与处理方法 对照组未做任何处理，正常饲养；其余3组于实验第1、2天按每只大鼠450 mg/kg的剂量腹腔注射氯苯丙氨酸（PCPA）造睡眠剥夺模型，造模成功后，模型组不再做任何处理；安定组于实验第3天按人-鼠给药体表面积折算计量0.92 mg/kg给予腹腔注射安定，每日1次，连续5 d；电针组给予电针百会、神庭20 min，每日1次，连续5 d。（参照《常用实验动物针灸穴位图》，神庭位于大鼠头部前正中线上，在额顶骨缝交界线前方处；百会位于大鼠头部顶骨正中，两耳连线中点。电针操作：取0.22 mm×25 mm无菌针灸针斜刺或平刺百会、神庭，进针3～5 mm后连接电针仪，选用连续波型，电压6 V，频率10 Hz，留针20 min）。各组大鼠均于实验第8天行旷场实验后在戊巴比妥钠麻醉下收集脾脏作为实验样本。

1.3 指标检测

1.3.1 旷场实验（Open field test）检测及方法 旷场实验箱长、宽、高为100 cm×100 cm×40 cm，箱底面按20 cm×20 cm大小平均分为25个方格，四壁内侧面涂黑，不和内壁交界的9个方格作为中央格，余为外周区域。以大鼠穿越底面方格数（4只爪子均进入方格才可计数）为水平得分；以大鼠直立的次数（攀附墙壁或前爪腾空均算）为水平得分；并记录大鼠在中央格停留的时间。

测定条件：行为学实验场所保持安静、通风，选择在可调控光强度的暗室中进行，光照强度在10 Lux最宜。实验开始前，各组大鼠需在测定房中适应10 min以上。实验开始后，将大鼠放在旷场实验箱底面最中央的方格内，然后实验者迅速离开暗室，通过窗口观察大鼠3 min内穿越底面方格数、直立的次数以及在中央格停留的时间并录像。每次测试结束后，清理大鼠留下的粪便和尿液，并擦拭箱底和内壁，以免影响下一只大鼠的测试结果。每只仅测定1次，实验结束后由3名以上实验人员采用盲法原则进行录像分析。

1.3.2 大鼠脾脏IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的检测及方法 采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法，取10 mg脾脏组织使用组织捣碎机破碎细胞匀浆提取总RNA，用反转录试剂盒配制反转录反应体系得到反转录产物cDNA；采用SYBR Green I荧光法，以β-actin为内参基因，引物序列见表1，反应总体系为15 μL，95℃预变性5 min，95℃变性10 s，60℃退火延伸34 s，共40个循环。反应结束后，将获得的循环阈值（cycle threshold CT），采用ΔΔCT （ΔΔCT=ΔCT-ΔCT基础值；ΔCT=CT目的基因-CT内参）方法分析，根据2-ΔΔCt公式计算目的基因的相对表达量。

表1 RT-PCR的引物序列Tab.1 Primer sequence of RT-PCR

1.4 统计学方法 使用ABI7500 software（Version 2.0.5）和DataAssist3.01软件对数据进行处理，用公式2-ΔΔCt计算基因相对表达量RQ值，计算出的结果用SPSS 18.0软件进行分析，所有数据以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析（One-Way-ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

旷场实验后统计分析数据表明：1）与对照组相比，模型组大鼠水平得分、垂直得分和中央格停留时间明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；2）与模型组相比，安定组和电针组水平得分、垂直得分和中央格停留时间明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠旷场实验分析表（±s）Tab.2 Analysis table of open field test of each group（±s）

表2 各组大鼠旷场实验分析表（±s）Tab.2 Analysis table of open field test of each group（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别动物数水平得分（分）垂直得分（分）中央格停留时间（s）对照组 8 24.63±7.95 8.25±3.11 6.82±2.94模型组 8 33.50±8.60* 11.75±3.58* 11.34±3.86#安定组 8 22.88±5.91#6.38±3.50#6.71±2.41#电针组 8 22.00±8.57#7.50±3.07#7.68±2.88#

RT-PCR数据表明：1）与对照组相比，模型组大鼠脾脏IL-1β和TNF-α含量显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.01），而IL-6无统计学差异（P＞0.05）；2）与模型组相比，安定组和电针组脾脏IL-1β和TNF-α含量显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），IL-6虽无统计学意义（P＞0.05），但有减少趋势；3）与对照组相比，安定组、电针组大鼠脾脏IL-1含量升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），IL-6 和TNF-α含量趋势升高，但无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠脾脏IL-1、IL-6、TNF-α基因的表达水平比较（±s）Tab.3 Comparison of IL-1，IL-6 and TNF-α gene expression in the spleen of each group（±s）

表3 各组大鼠脾脏IL-1、IL-6、TNF-α基因的表达水平比较（±s）Tab.3 Comparison of IL-1，IL-6 and TNF-α gene expression in the spleen of each group（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.01，有统计学差异；与模型组比较，#P＜0.05，有统计学差异。

组别 动物数 IL-1 RQ值 IL-6 RQ值对照组 8 1.00±0.00 1.00±0.00模型组 8 1.83±0.19* 1.33±0.21安定组 8 1.31±0.17*#1.27±0.25电针组 8 1.33±0.15*#1.30±0.24 TNF-α RQ值1.00±0.00 1.45±0.17 1.28±0.13 1.37±0.10

3 讨论

旷场实验中水平得分可反映实验动物的活跃程度，垂直得分可反映了实验动物对新环境的好奇程度，这两者均可反映实验动物的兴奋性；中央格停留时间可反映实验动物对外界环境的认知能力，如果对新环境的认知能力差，则停留在中央格的时间就会延长。本实验在白天进行，正是大鼠安静的时间，活动性相对较低，然而模型组活动量增高，这说明模型组大鼠经过睡眠剥夺后睡眠-觉醒周期紊乱，兴奋性增强，认知能力逐渐下降；而电针组在经过实验干预后活动量趋于对照组，这说明电针百会、神庭可以调节睡眠剥夺大鼠的睡眠-觉醒周期，改善兴奋状态，解除睡眠剥夺状态。

脾脏作为机体最大的二级免疫器官，是细胞免疫和体液免疫的主要发生场所，是产生免疫应答的主要器官，在机体免疫系统中扮演着十分重要的角色。睡眠的调节相当复杂，关于睡眠机制的研究，目前涌现出许多新的观点。有人认为睡眠觉醒行为和睡眠结构是通过微生物产物和炎性细胞因子完成的，其中较重要的有IL-1β、IL-6和TNF-α等。在睡眠过程中，它们具有一定的昼夜节律性能不同程度地促进睡眠［4］。早在1984年当兔脑室内注入提纯的IL-1时，非快速动眼型睡眠（NREM）时间延长，并与剂量呈正相关［5］。有研究发现睡眠缺乏或日间过度嗜睡者IL-6水平升高，白天IL-6水平与前一夜睡眠的深度质量负相关，夜间睡眠剥夺后次日白天血循环中过度分泌IL-6［6］。测定睡眠剥夺后大鼠血清细胞因子水平发现，睡眠剥夺24h后TNF-α明显高于正常对照组［7］。Shearer用模拟太空飞行对人进行睡眠剥夺后，用酶联免疫法测定血浆IL-6、TNF-α等受体结果发现，全部睡眠剥夺测试者体内IL-6和TNF-α血浆浓度均增高［8］。

由此可见，IL-1β、IL-6和TNF-α等细胞因子是睡眠的重要调节因子之一，不仅对生理性睡眠具有调节作用，而且在许多与睡眠相关疾病中都存在细胞因子的异常表达，并发生相应的节律性变化，改善失眠症状。但是，细胞因子分泌格局及其平衡一旦被打破，则有可能导致机体的细胞免疫和体液免疫的紊乱。因为这些细胞因子的生物学功能具有双重性，一方面具有治疗和抗御疾病的有益生物学活性，例如抗感染、纠正免疫缺陷等作用，但另一方面细胞因子具有介导或促进疾病发生发展的病理学作用。有研究报道，体内持续升高的细胞因子可引起或加重慢性感染，如慢性自身免疫性疾病、变态反应性疾病等［9］。IL-1β能诱导中枢神经系统中某些重要的神经毒性分子的释放，促进脑内基质金属蛋白酶-9的合成，进而致使神经细胞外基质遭到破坏［10］，部分细胞因子特别是IL-6、TNF-α参与了癌症恶病质的发生和发展过程［11］。此外，还有研究表明，炎症反应贯穿于AS发生和发展的全过程［12］。大量炎症因子的产生和释放与AS斑块的进展密切相关［13］。

因此，我们推测，通过腹腔注射PCPA可以使大鼠体内免疫应激水平升高，体内细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平也随之升高，随着睡眠剥夺的持续，机体免疫通路则可能会处于一个相对过表达的状态，体内免疫反应持续进行，细胞因子也随之继续增加，并给机体带来不同程度的炎症损害。经过电针干预后，大鼠睡眠-觉醒周期趋于恢复，体内细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α过表达水平得到控制，既起到调节改善睡眠的作用，也调节失衡的免疫功能，解除睡眠剥夺对机体的损害。这说明电针治疗失眠的机理之一是通过抑制免疫通路的某些因子或者促使其他因子表达来调控免疫通路，这将是我们今后研究的重点。

参考文献：

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［12］Ross R. Atherosclerosis：An inflammatory disease［J］. N Engl J Med，1999，340（2）：115-126.

［13］Annakabla KZ，Tadeusz P Andrzej S，et al. Carotid intima-media thickness，hs-CRP and TNF-αare independently associated with cardiovascular event risk in patients with atherosclerotic occlusive disease［J］. Atherosclerosis，2011，214（1）：185-190.

（本文编辑：马 英，张震之）

·中药研究·

Effects of electro-acupuncture on behavior change and cytokines IL-1β，IL-6，TNF-α in the spleen of sleep deprivation rats

HU Tian-jun1，YU Jie1，WANG Xiu-lian1，HE Yang-zi2
（1.Jinan University，Guangzhou 510630，China；2.The First Affiliated Hospital of Jinan University，Guangzhou 510630，China）

Abstract:［Objective］To observe the effect of electro-acupuncture on behavior change and the cytokines of IL-1β，IL-6，TNF-α in the spleen of sleep deprivation rats to investigate the mechanism of electro-acupuncture treatment in insomnia.［Methods］Thirty-two Wistar rats with SPF level were randomized into the control group，model group，diazepam group and electro-acupuncture group. The sleep deprivation rats were established by DL-P-Chlorophenylalanine（PCPA）abdominal injection. The diazepam group were treated by diazepam，and the electro-acupuncture group were treated by electro-acupuncture with Baihui（GV20）and Shenting（GV24）acupoints. Behavior change and the cytokines of sleep deprivation rats were observed and analyzed by real time-PCR after 5 days continuously treatment.［Results］Comparison with the control group in the open field test，the crossing scores，the rearing scores and the pace time in center of the rats were significantly up-regulated in the model group（P＜0.05）. On the other hand，all of those scores mentioned above were significantly increased in the group of diazepam and electro-acupuncture（P＜0.05）. In the results of real time-PCR，the IL-1β and the TNF-α expression levels were remarkably higher in the model group than in the control group（P＜0.01）. Furthermore，the IL-1β and the TNF-α expression levels in the diazepam group and the electro-acupuncture group were Significantly down-regulated（P＜0.05）. But there was no obviously results in each group with the level of IL-6（P＞0.05）.［Conclusion］The electro-acupuncture can effectively treat the symptoms of Insomnia，and it also can proper control the level of cytokines.

Key words:electro-acupuncture；sleep deprivation；cytokine

中图分类号：R256.23

文献标志码：A

文章编号：1672-1519（2016）01-0035-04

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2016.01.09

作者简介：胡天俊（1986-），男，硕士研究生，研究方向为针灸治疗神经系统疾病。

通讯作者：何扬子，E-mail：thzy@jnu.edu.cn。

收稿日期：（2015-09-21）