生肌象皮膏对2型糖尿病大鼠溃疡肉芽组织的Th1/Th2淋巴细胞平衡的影响*

李巧芬，常 柏，李春深（.天津中医药大学，天津 30093；.天津医科大学代谢病医院，天津 300070）



生肌象皮膏对2型糖尿病大鼠溃疡肉芽组织的Th1/Th2淋巴细胞平衡的影响*

李巧芬1，常 柏2，李春深1
（1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津医科大学代谢病医院，天津 300070）

摘要：［目的］探讨生肌象皮膏对糖尿病大鼠溃疡组织Th1/ Th2淋巴细胞平衡的影响。［方法］将Wistar大鼠随机分为4组，1组为正常对照组，其余3组采用链脲佐菌素（STZ）尾静脉注射制备糖尿病模型，4组动物均于背部进行打孔处理，造成正常对照大鼠溃疡模型与糖尿病溃疡模型。糖尿病溃疡大鼠按照血糖和体质量分层随机分为糖尿病对照组、凡士林组与生肌象皮膏组。观察创面组织白细胞介素（IL）-2、IL-4、IL-10和干扰素-γ（IFN-γ）含量的变化。［结果］与正常对照组比较，糖尿病对照组大鼠溃疡肉芽组织中IL-2及IFN-γ的表达于实验各个时间点均升高IL-2 及IFN-γ的表达于实验各个时间点均升高（P＜0.05），而IL-4及IL-10的含量于实验各个时间点均降低（P＜0.05）；与糖尿病对照组比较，生肌象皮膏组大鼠溃疡肉芽组织中IL-2及IFN-γ的表达于实验3、7、14、21、30 d均明显降低，而IL-4及IL-10的表达于实验3、7、14和21天增加（均于实验7 d达到高峰），P＜0.05。［结论］生肌象皮膏促进糖尿病大鼠溃疡创面的愈合与其调节溃疡肉芽组织的Th1/Th2淋巴细胞的平衡有密切联系。

关键词：生肌象皮膏；糖尿病溃疡；免疫-炎症反应；IL-2；IL-4；IL-10；IFN-γ

糖尿病溃疡是导致糖尿病患者截肢致残的主要原因。预计到2025年全球糖尿病患者可能会达到2.5亿人以上，其中大约有15%将发生糖尿病性溃疡或坏疽［1］。中医药治疗糖尿病性溃疡优势独特，生肌象皮膏是中医外用药，具有生肌长皮、活血养血之功效。笔者应用生肌象皮膏在临床上治疗糖尿病溃疡取得良好效果［2-3］，并对生肌象皮膏促进糖尿病溃疡愈合的机制进行探讨［4-5］。依据分泌的细胞因子不同，Th细胞可分成Th1［分泌白细胞介素（IL）-2和干扰素-γ（IFN-γ）］与Th2（主要分泌IL-4和IL-10）的两类亚群。Th1类细胞主要参与细胞免疫或迟发性超敏反应，而Th2类细胞则主要参与体液免疫反应。Th1和Th2细胞两个亚群存在细胞免疫与体液免疫反应的交互抑制现象，进而影响炎症-免疫反应［6］。本文从Th1/Th2淋巴细胞平衡改变的角度探讨生肌象皮膏对炎症-免疫反应的影响及其促进糖尿病溃疡愈合的机制。

1 材料

生肌象皮膏主要成分为象皮粉，而药物的来源受到限制（大象属于二级保护动物），故天津中医药大学第一附属医院制剂室应用驴皮代替象皮制备生肌象皮膏；凡士林（天津中医药大学第一附属医院提供）；链脲佐菌素（STZ，sigma公司，批号：S0130）；Universal 16R低温高速离心机（Beckman公司）；高效液相色谱仪（美国Waters公司）；血糖测定试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）。

2 方法

2.1 大鼠糖尿病溃疡模型建立与分组 雄性Wistar大鼠，体质量（180±20）g，天津实验动物中心提供，清洁级，动物合格证号：SCXK津2005-001。随机选取其中15只大鼠，作为正常对照组，以普通饲料饲养，于实验第12周时在无菌条件下用特制打孔器对所有大鼠在背部打孔，建立正常对照组溃疡创面模型；其余实验大鼠以高脂高热卡饲料喂养，于实验第12周采用尾静脉注射STZ的方法建立糖尿病大鼠模型，72 h后检测随机血糖超过16.7 mmol/L为糖尿病造模成功，于无菌条件下用特制打孔器对糖尿病大鼠在背部打孔，建立糖尿病溃疡创面模型，然后按照血糖和体质量随机将其分为糖尿病对照组、凡士林组和生肌象皮膏组。

2.2 实验动物用药 正常对照组和糖尿病对照组大鼠予以溃疡创面严格外科无菌换药，并配以生理盐水纱布外敷。高温高压分别制成无菌生肌象皮膏纱条与凡士林纱条，分别完全覆盖于生肌象皮膏组和凡士林组大鼠的溃疡创面，外用无菌纱布包扎固定。各组大鼠均每日换药1次。

2.3 动物溃疡组织标本获取及指标检测 各组实验大鼠于用药的第1天、第3天、第7天、第14天、第21天及第30天（6个时间节点）进行创面组织照相，对应前述6个时间节点依次取创面溃疡组织标本。分别将各组动物溃疡组织标本剪碎，加入生理盐水，以匀浆器制成20%匀浆，以5 000 r/min速度进行离心，其上清液置于-20℃冰箱冻存，作为待检测标本。检测程序严格按试剂盒使用说明进行，采用双抗体夹心酶联免疫吸附（ELISA）法定量分析检测溃疡组织中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ含量。用大鼠待检测的蛋白单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的待测蛋白与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠待测蛋白抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入酶底物，出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，颜色的深浅和样品中的检测指标呈正相关，在490nm处取A值，绘制标准曲线，根据标本A值在标准曲线上得到溃疡组织标本中IL-2、IL-4、IL-10 和IFN-γ的浓度数值。

2.4 实验数据处理 采用SPSS18.0分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用重复测量方差分析，两两比较时，组间方差齐性的采用LSD法，方差不齐的采用DUNNET’S T3法，P＜0.05为具有显著性差异。

3 实验结果

3.1 大鼠溃疡肉芽组织中Th1淋巴细胞分泌IL-2 和IFN-γ的改变 与正常对照组比较，糖尿病对照组大鼠溃疡肉芽组织中IL-2及IFN-γ的表达于实验各个时间点均升高（P＜0.05）；与糖尿病对照组比较，生肌象皮膏组大鼠溃疡肉芽组织中IL-2及IFN-γ的表达于实验3、7、14、21、30 d均明显降低，P＜0.05。见表1、表2。

3.2 大鼠溃疡肉芽组织Th2淋巴细胞分泌IL-4和IL-10的变化 与正常对照组比较，糖尿病对照组大鼠溃疡肉芽组织中IL-4及IL-10的含量于实验各个时间点均降低（P＜0.05）；与糖尿病对照组比较，生肌象皮膏组大鼠溃疡肉芽组织中IL-4及IL-10的表达于实验3、7、14、21 d增加（均于实验7 d达到高峰），P＜0.05。见表3、表4。

表1 各组大鼠溃疡肉芽组织中IL-2含量的比较（±s）Tab.1 Comparison of IL-2 contents in ulcer granulation tissue in the rats of each group （±s）ng/L

表1 各组大鼠溃疡肉芽组织中IL-2含量的比较（±s）Tab.1 Comparison of IL-2 contents in ulcer granulation tissue in the rats of each group （±s）ng/L

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与糖尿病组比较，#P＜0.05。

1 d 3 d 48.71±5.720 50.64±6.8200 56.85±7.25* 67.18±8.24*0 55.75±7.28* 65.42±7.04*0 55.57±6.14* 57.18±6.24#组别正常对照组糖尿病对照组凡士林组生肌象皮膏组动物数10 10 10 10 7 d 48.95±5.1500 87.20±8.47*0 72.82±8.48*0 68.76±5.14#14 d 21 d 30 d 53.84±6.1400 57.51±6.8700 67.51±7.1500 98.56±9.02*0 99.13±9.51*0 89.45±8.21*0 91.57±9.84*0 86.82±8.03*0 66.42±7.9200 73.58±6.50#67.05±7.44#63.70±7.05#

表2 各组大鼠溃疡组织中IFN-γ水平的比较（±s）Tab.2 Comparison of the level of IFN-γ in ulcer granulation tissue in the rats of each group（±s）ng/L

表2 各组大鼠溃疡组织中IFN-γ水平的比较（±s）Tab.2 Comparison of the level of IFN-γ in ulcer granulation tissue in the rats of each group（±s）ng/L

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与糖尿病组比较，#P＜0.05。

1 d 3 d 28.71±4.03* 35.08±8.52* 39.19±5.48* 57.37±7.67* 36.72±5.33* 53.35±6.80* 37.15±5.25* 45.82±6.81#组别正常对照组糖尿病对照组凡士林组生肌象皮膏组动物数10 10 10 10 7 d 44.78±6.25* 60.43±7.22** 58.21±10.49** 53.04±5.72#14 d 21 d 30 d 48.10±6.13** 46.27±7.53** 42.17±7.24** 78.43±8.94** 67.81±9.47** 66.94±7.57** 71.75±8.03** 65.49±8.87** 63.17±8.27** 57.48±7.53#60.87±8.74#59.26±6.29#

表3 各组大鼠溃疡肉芽组织中IL-4含量的比较（±s）Tab.3 Comparison of IL-4 concents in ulcer granulation tissue in the rats of each group（±s）ng/L

表3 各组大鼠溃疡肉芽组织中IL-4含量的比较（±s）Tab.3 Comparison of IL-4 concents in ulcer granulation tissue in the rats of each group（±s）ng/L

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与糖尿病组比较，#P＜0.05。

1 d 3 d 97.40±9.61 99.72±9.82 68.01±9.37* 67.34±9.41* 69.47±9.50* 68.54±9.84* 67.43±9.48* 76.79±9.83#组别正常对照组糖尿病对照组凡士林组生肌象皮膏组动物数10 10 10 10 7 d 98.48±10.12* 63.62±9.43** 68.46±9.71** 82.68±9.04#14 d 21 d 30 d 89.38±9.73** 86.82±10.67* 79.35±11.80 69.62±8.07** 67.56±8.29** 67.71±8.85* 62.24±7.57** 60.35±9.84** 68.29±8.91* 78.57±9.29#66.57±9.72** 64.64±9.16*

表4 各组大鼠溃疡肉芽组织中IL-10含量的比较（±s）Tab.4 Comparison of IL-10 contents in ulcer granulation tissue in the rats of each group（±s）ng/L

表4 各组大鼠溃疡肉芽组织中IL-10含量的比较（±s）Tab.4 Comparison of IL-10 contents in ulcer granulation tissue in the rats of each group（±s）ng/L

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与糖尿病组比较，#P＜0.05。

组别正常对照组糖尿病对照组凡士林组生肌象皮膏组动物数10 10 10 10 1 d 3 d 97.24±9.71* 95.85±10.05* 56.81±7.06* 57.51±9.38** 57.15±6.86* 59.46±9.40** 56.80±6.84* 75.48±8.151#7 d 91.08±9.85** 52.45±8.48** 59.14±8.23** 89.12±9.44#14 d 21 d 30 d 89.31±10.06* 77.15±8.25** 65.34±7.09** 41.54±5.81** 38.75±4.64** 37.41±4.05** 53.91±7.30** 50.10±7.04** 41.46±6.81** 82.41±7.72#75.44±8.50#50.16±8.35#

4 讨论

生肌象皮膏由象皮、当归、血余炭、龟版、生地等组成，是生肌长皮的代表方剂。方中以象皮为主药，配以滋阴养血及活血化瘀收敛之品，共奏生肌长皮、活血养血之功效［7-8］。经临床应用与研究证实，生肌象皮膏具有消炎抑菌、促进肉芽组织生长的作用，可改善微循环，提高局部组织的抗感染能力，促进残存上皮细胞和创面周围上皮细胞的良好生长，加快创面组织愈合［9-10］。

T细胞亚群在创伤后会发生明显变化，在创伤早期Ts细胞数量会明显增多，但Th细胞的数量无明显变化，从而Ts细胞总数比例较大，这又会直接影响其他T细胞亚群以及巨噬细胞，导致广泛的免疫抑制［11］。Th1/Th2在创伤或烧伤后的平衡被打破使Th2出现诱导反应占优势的克隆转移，成为造成细胞免疫功能降低的重要原因。免疫活化的淋巴细胞分别产生淋巴因子和抗体，发挥其杀伤病原微生物的作用［12-13］。

Th细胞依据其分泌的细胞因子不同而划分成Th1/Th2两亚群，期中Th1类细胞分泌IL-2、IFN-γ和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），主要参与细胞免疫或迟发性超敏反应；Th2类细胞分泌IL-4、IL-5、IL-10，主要参与体液免疫反应［14］。Th1和Th2细胞两个亚群存在细胞免疫与体液免疫反应的交互抑制现象，Thl细胞产生的IL-2、IFN-γ和TNF-α可增强单核/巨噬细胞活化介导的抗感染机制，促进细胞免疫，使巨噬细胞分泌的IL-12增加，诱导原始CD4+T细胞向Thl的细胞分化［15］。这种存在于Th1细胞与单核/巨噬细胞的正反馈通路使得先天固有性免疫与后天适应性免疫应答的建立了密切联系［16］。上皮屏障功能障碍造成上皮细胞损伤而引起组织结构重塑中，以为Th2特征的炎症反应是一个不断变化的，从而防止进一步的损伤发生［17］。

Th2细胞产生的IL-4和IL-10通过刺激肥大细胞和嗜酸性粒细胞的生长和活化、刺激B细胞分化成浆细胞以及Ig类别的转换等促进体液免疫，这些细胞因子可抑制巨噬细胞激活、T细胞增殖以及促炎因子产生［18］。Th2细胞因子IL-4和IL-10成为重要的抗炎细胞因子［19］。由此可见，Thl和Th2细胞之间存在相互抑制，其平衡被打破则可导致免疫性疾病的产生［20］。

本实验结果显示，与糖尿病对照组比较，生肌象皮膏组大鼠溃疡肉芽组织中IL-2及IFN-γ的表达于实验3、7、14、21、30 d均明显降低，同时IL-4 及IL-10的表达于实验3、7、14、21 d增加，均于实验7 d达到高峰。

5 总结

目前，治疗糖尿病溃疡的方法较多，各有优势又都存在不足，而导致糖尿病溃疡的因素是多方面的，中医药学治疗糖尿病溃疡具有一定的优势，但在某些机制方面还不是很清楚。生肌象皮膏作用于糖尿病大鼠溃疡创面，通过抑制促炎因子与增加抗炎因子的含量，维持Th1/Th2淋巴细胞的功能平衡，进一步影响炎症-免疫反应，从而促进糖尿病溃疡伤口愈合的过程。这种作用是否会更为广泛的影响溃疡创面细胞因子的含量及其关系，有待进一步研究。

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（本文编辑：马 英，张震之）

Influence on the balance of Th1/Th2 lymphocyte in the ulcer healing in type 2 diabetic rats treated by the Shengji Xiangpi mastic

LI Qiao-fen1，CHANG Bai2，LI Chun-shen1
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Metabolic Diseases Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China）

Abstract:［Objective］To investigate the influence on the balance of Th1/Th2 lymphocyte in the ulcer healing in diabetic rats treated by the Shengji Xiangpi mastic（SM）.［Methods］Wistar rats were randomly divided into four groups，one group as the normal control group，the remaining three groups rats injected STZ into vena caudalis as the diabetic model. All the four group rats were punched in back，establishing the diabetic ulcer model. The three group rats of diabetic ulcers were randomly divided into diabetic control group，vaseline group and SM group by the blood glucose and body weight. The changes of IL-2、IL-4、IL-10 and IFN-γ in the wound tissue were observed.［Results］Compare with the rats in normal control group，the contents of IL-2 and IFN-γ were higher and the contents of IL-4 and IL-10 were lower at each selected time point in the rats of the diabetic control group during the experiment，and the difference was significant respectively. Compare with the rats in diabetic control group，the contens of IL-2 and IFN-γ were lower on the 3th，7th，14th，21th，30th day，while the contents of IL-4 and IL-10 on the 3th，7th，14th and 21th day were higher in the rats of SM group，and the difference was significant respectively.［Conclusion］The role of Shengji Xiangpi mastic promoting the ulcer healing in diabetic rats，was closely related to regulate the balance of Th1/Th2 lymphocyte.

Key words：Shengji Xiangpi mastic；diabetic ulcer；immune-inflammation reaction IL-2；IL-4；IL-10；IFN-γ

中图分类号：R587.2

文献标志码：A

文章编号：1672-1519（2016）01-0031-04

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2016.01.08

*基金项目：国家自然科学基金资助项目（81373846）。

作者简介：李巧芬（1972-），硕士，副主任医师，从事内分泌疾病的临床及实验研究。

通讯作者：李春深，E-mail：lichunshen@126.com。

收稿日期：（2015-09-26）