穿心莲连作土壤提取物对其种子的化感作用

李俊仁，陈秀珍，刘凯频，彭秋菊，詹若挺，何瑞

（1.广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心，岭南中药资源教育部重点实验室，国家中成药工程技术研究中心南药研发实验室，广东广州　510006；2.广州中医药大学中药学院，广东广州　510006）



穿心莲连作土壤提取物对其种子的化感作用

李俊仁1，陈秀珍1，刘凯频2，彭秋菊2，詹若挺1，何瑞1

（1.广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心，岭南中药资源教育部重点实验室，国家中成药工程技术研究中心南药研发实验室，广东广州510006；2.广州中医药大学中药学院，广东广州510006）

摘要：【目的】考察不同质量浓度穿心莲连作土壤提取物对其种子的化感作用。【方法】制备连作0年、连作1年及连作2年的穿心莲栽培土壤水、醇提取物，稀释至不同试验浓度用于穿心莲种子发芽试验。【结果】穿心莲连作土壤的水提物及醇提物均对穿心莲种子的发芽指数、发芽势、发芽率及胚根长有不同程度的抑制作用，但其抑制作用与连作年限无明显关联，3个连作年限土壤的抑制效果比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。水提物中，以125 mg/mL的抑制效果最强。醇提物中，高浓度醇提物的抑制作用较强，尤以抑制胚根长度的作用最为明显。在水提物和醇提物作用下，穿心莲种子各萌发指标的化感效应指数（RI）均RI＜0，并且化感综合效应（SE）也均SE＜0。【结论】穿心莲连作土壤提取物对其种子萌发存在化感抑制作用，化感作用可能是造成穿心莲连作障碍的原因之一。

关键词：穿心莲/生长和发育；连作土壤提取物；种子萌发；化感作用

穿心莲（Andrographis Herba）来源于爵床科（Acanthaceae）植物穿心莲［Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees］的干燥地上部分，为《中华人民共和国药典》（2015年版）收载品种，是临床常用中药材，可用于治疗感冒发热、咽喉肿痛、口舌生疮、热淋涩痛、痈肿疮疡、蛇虫咬伤等症［1］。在我国穿心莲野生资源极其少见，99%以上的商品药材均来源于栽培种［2］；生产上普遍认为穿心莲存在连作障碍［3］，在种植中通常避免重茬。植物化感自毒作用被认为是导致药用植物连作障碍的主要原因之一［4］。穿心莲主要含二萜内酯类化合物［5］及黄酮类化合物［6］，这2类次生代谢产物均为强化感物质［7］；这些化感物质可通过根系分泌、茎叶的淋溶物及残体降解等途径进入土壤，使根际土壤环境日益恶化，导致连作障碍的产生或加重［8］。目前，关于穿心莲的连作障碍研究多集中在营养体（根、茎、叶）的化感作用方面［9～11］，但对于穿心莲连作土壤对其种子的化感作用的研究却鲜有报道。因此，本研究就穿心莲连作土壤水提物、醇提物对其种子萌发的影响进行了探讨，以期为穿心莲的规范化种植提供一定的理论依据，现报道如下。

1　材料与方法

1.1供试样品于2013年9月（穿心莲生长旺盛期）收集连作0年（指第1次种植穿心莲的新土壤）、连作1年（指同样的土壤第2次种植穿心莲）以及连作2年（指同样的土壤第3次种植穿心莲）的穿心莲栽培土壤（试验地位于广州中医药大学药圃内），剔除根系及其茎叶残留物以及其它杂物，混合均匀后晒干，过五号筛（80目），即得分析用土壤样品。试验所用土壤（之前连续2年的新土低浓度实验数据证明移栽3个月后土壤的抑制作用均较移栽初期增强，说明随着种植穿心莲的时间增加，新土中的物质对种子萌发的影响增强）为产自台湾翠筠有限公司的商业园艺专用土“靓土”（土壤pH 5.6，质量分数为有机质52%、全氮0.5%、全磷0.1%、全氧化钾0.4%；主要原料包括泥炭土、椰子纤维、珍珠石、蛭石以及碳化稻壳）。供试穿心莲种子由广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心提供，于2009年10月收集自广西贵港市，经詹若挺研究员鉴定为爵床科植物穿心莲［（Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees］的种子，发芽率为63.2%，含水量为11.6%，按规定水分13.0%计算千粒质量为1.108 0 g。

1.2仪器和试剂低温冰箱（BCD-218SDA，青海海尔股份有限公司）；万分之一天平（BS224，赛多利斯科学仪器有限公司）；打粉机（FD-1000，瑞安市飞腾制药机械厂）；恒温摇床（WR-1，上海思尔达科学仪器有限公司）；抽滤机（GM-0.35，天津腾达实验设备有限公司）；智能人工气候培养箱（ZRX-258E，杭州钱江仪器设备有限公司）；体积分数30%双氧水（天津百世化工有限公司）；甲醇（天津百世化工有限公司）；去离子水（美国Millopore超纯水系统）。

1.3供试液的制备

1.3.1穿心莲连作土壤水提物的制备称取经干燥的土壤样品粉末50 g，纱布包裹后置于烧杯中，加入100 mL去离子水，摇床浸提2 d（100次/min），抽滤所得滤液加水补足至100 mL，得到质量浓度为500 mg/mL（土壤干质量/水）的穿心莲连作土壤水提物；再按倍量稀释法，用去离子水分别稀释至250、125、62.5 mg/mL，于4℃冰箱保存备用。

1.3.2穿心莲连作土壤醇提物的制备称取经干燥的土壤样品粉末35 g，加500 mL 40%（体积分数，下同）甲醇浸泡24 h后进行抽滤，得初滤液；将滤渣继续加200 mL体积分数40%甲醇浸泡24 h，抽滤得续滤液。合并滤液，减压浓缩（温度设置为50℃）至少量，再加水定容至5 mL，即得土壤醇提物；将土壤醇提物用去离子水稀释至350 mg/mL和700 mg/mL（土壤干质量/水），于4℃冰箱保存备用。

1.4穿心莲种子萌发试验土壤水提物试验设置4个处理浓度（62.5、125、250、500 mg/mL），土壤醇提物设置2个处理浓度（350、700 mg/mL），均以去离子水为对照（CK）。穿心莲种子随机分组，去离子水浸种24 h，体积分数为0.3%H2O2消毒10 min后，用消毒去离子水冲洗干净进行发芽试验，以纸上为发芽床，每个培养皿置50粒种子并加入相应浓度的土壤水或醇提物5 mL，每个处理浓度设4个重复。发芽条件参考童家赟等［12］确定的条件，27.5℃，光照10 h/d，培养7 d。试验期间保持发芽床湿润，每天观察记录种子发芽情况。试验结束后统计相关指标数据。

1.5指标测定

1.5.1发芽率p发芽率（%）=试验中所有发芽种子数/供试种子数×100%。

1.5.2发芽势p发芽势（%）=规定天数内发芽种子数/供试种子数×100%。

1.5.3发芽指数GI=∑（Gt/Dt）（Gt为置种后第t天的发芽数，Dt为相应的发芽试验天数）。

1.5.4幼根长度测量将发芽种子置于标准坐标纸拍照后，用Image-Pro Plus 6.0软件对幼根长度进行测量。

1.5.5化感效应敏感指数（RI）计算参照Williamson等［13］的方法，即：RI=1-C/T（当T＞C时），RI= T/C-1（当T＜C时）；其中C为对照值，T为处理值。RI＞0为促进作用，RI＜0为抑制作用，绝对值的大小与强度一致。

1.5.6化感综合效应（SE）用以综合比较各因素不同水平、各处理组合及受体各指标的化感作用强度。用测试指标的RI值相加的平均值进行评价，即SE =（RI1+ RI2+……+ RIn）/n。SE＞0为促进作用，SE＜0为抑制作用，绝对值的大小与作用强度一致。

1.6统计方法采用SPSS 19.0统计软件，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果与分析

2.1土壤提取物对穿心莲种子发芽指数的影响发芽指数反映了种子的发芽速率和整齐程度，发芽指数越高，说明种子的发芽速率和整齐度高。图1结果显示：质量浓度为250 mg/mL时，随着连作年限的增加，土壤水提物对种子的发芽指数抑制作用增强，其中连作2年较正茬（连作0年）下降38%，差异有统计学意义（P＜0.05）。质量浓度为500 mg/mL时，随着连作年限的增加，发芽指数总体呈上升趋势，且与正茬比较，连作1年及连作2年分别增加了105%和115%，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图2结果显示：在所测试的2个穿心莲连作土壤醇提物质量浓度中，与对照组比较，醇提物均降低了其种子的发芽指数；各处理浓度较对照组下降24%～40%（P＜0.05）。但连作1年及2年与正茬比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图2　穿心莲连作土壤醇提物对其种子发芽指数的影响Figure 2 Effect of methanol extracts of continuously cropped soil on germination index of Andrographis paniculata seeds　（±s，N=4）

2.2土壤提取物对穿心莲种子发芽势的影响种子发芽势是指种子发芽初期，正常发芽种子数占供试种子数的百分率。种子发芽势高，则表示种子活力强，发芽整齐，出苗一致，增产潜力大。图3结果显示：发芽势的趋势与发芽指数的大体一致。在质量浓度为250 mg/mL时，土壤水提物对发芽势的抑制作用随着连作年限的增加而增强，其中，连作2年的较正茬的下降了38%，差异有统计学意义（P＜0.05）。而当质量浓度为500 mg/mL时，发芽势的总体趋势却与250 mg/mL时相反，总体呈上升趋势。

图3　穿心莲连作土壤水提物对其种子发芽势的影响Figure 3 Effect of water extracts of continuously cropped soil on germination potential of Andrographis paniculata seeds　（±s，N=4）

图4结果显示：醇提物2个测试的质量浓度与对照组比较，连作土壤醇提物处理的穿心莲种子发芽势降低，其中高浓度组的降低55%～62%，差异有统计学意义（P＜0.05）。但与正茬比较，连作土壤组差异无统计学意义（P＞0.05）。

图4　穿心莲连作土壤醇提物对其种子发芽势的影响Figure 4 Effect of methanol extracts of continuously cropped soil on germination potential of Andrographis paniculata seeds　（±s，N=4）

2.3土壤提取物对穿心莲种子发芽率的影响种子发芽率是指在发芽试验末期，全部正常发芽种子数占供试种子数的百分率。种子发芽率高，表示有活力的种子多，播种后出苗数多。图5结果显示：在所测试的质量浓度在62.5～500 mg/mL范围内，随着连作年限的增加，土壤水提物对种子发芽率的抑制作用增强，总体呈下降趋势。与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与正茬比较，连作1年土壤差异均无统计学意义（P＞0.05），连作2年土壤除了500mg/mL组外差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图5　穿心莲连作土壤水提物对其种子发芽率的影响Figure 5 Effect of water extracts of continuously cropped soil on germination rate of Andrographis paniculata seeds（s，N=4）

图6结果显示：2个质量浓度穿心莲连作土壤醇提物处理的种子发芽率均低于对照组；与正茬比较，连作1年及2年土壤的发芽率差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图6　穿心莲连作土壤醇提物对其种子发芽率的影响Figure 6 Effect of methanol extracts of continuously cropped soil on germination rate of Andrographis paniculata seeds　（±s，N=4）

2.4土壤提取物对穿心莲种子胚根长度的影响图7结果显示：在质量浓度62.5～500 mg/mL范围内，水提物对穿心莲种子胚根长度的抑制作用随着连作年限的增加而加强。与对照组比较，各年限的125 mg/mL和250 mg/mL浓度组差异均有统计学意义（P＜0.05）；但各年限与正茬比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图7　穿心连作土壤水提物对其种子胚根长度的影响Figure 7 Effect of water extracts of continuously cropped soil on Andrographis paniculata radicle length　（±s，N=200）

图8结果显示：高、低浓度的土壤醇提物对穿心莲种子胚根的生长均有显著抑制作用，与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），胚根长度降低16%～66%；尤以高浓度组的差异最显著（P＜0.01）。同时，连作土壤醇提液浓度越高，其抑制作用越强。其中，连作1年土壤的高浓度组较正茬降低51%，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图8　穿心莲连作土壤醇提液对其种子胚根长度的影响Figure 8 Effect of methanol extracts of continuously cropped soil on Andrographis paniculata radicle length　±s，N=200）

2.5穿心莲连作土壤水提物对其种子萌发的化感效应表1结果显示：在所测试质量浓度62.5～ 500 mg/mL范围内，3个年限的连作土壤水提液对穿心莲种子的发芽指数、发芽势、发芽率和胚根长均有抑制作用，化感效应敏感指数RI为-0.68～-0.07。所测定的各项指标对不同浓度土壤水提液的敏感程度也有差异：就连作0年土壤而言，整体敏感顺序为发芽指数＞发芽势＞发芽率＞胚根长；连作1年土壤的整体敏感顺序为发芽势＞胚根长＞发芽率＞发芽指数；而连作2年土壤的整体敏感顺序为发芽指数＞发芽势＞发芽率＞胚根长。另外，就发芽率、胚根长度2个指标而言，随着连作年限的增加，其化感综合效应（SE）越大，抑制作用越强，但3个年限间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。同时，同一浓度对所有指标的综合影响效应也不同；在3个年限组别中，125 mg/mL浓度的化感综合效应值均较大，抑制作用较强。

表1　穿心莲连作土壤水提液对其种子萌发的化感效应Table 1 Allelopathy of water extracts of continuously cropped soil on Andrographis paniculata seed germination

2.6穿心莲连作土壤醇提物对其种子萌发的化感效应表2结果显示：3个连作年限的高、低质量浓度土壤醇提液对穿心莲种子的发芽指数、发芽势、发芽率和胚根长度均产生抑制作用，化感效应敏感指数RI为-0.66～-0.11。所测定的各项指标对不同浓度土壤醇提液的敏感程度存在差异：就连作0年土壤而言，整体敏感顺序为发芽指数＞发芽势＞胚根长度＞发芽率；就连作1年土壤而言，整体敏感顺序为胚根长度＞发芽指数＞发芽势＞发芽率；就连作2年土壤而言，整体敏感顺序为发芽势＞发芽指数＞胚根长度＞发芽率。同一浓度对所有指标综合影响效应也不同，但在各连作年限组别中，随着处理浓度的升高，其化感综合效应越大，抑制作用越强；其中，连作1年土壤中的高浓度（700 mg/ mL）组的抑制作用最强，尤其对胚根长度的抑制效果最明显。

表2　穿心莲连作土壤醇提物对其种子萌发的化感效应Table 2 Allelopathy of methanol extracts of continuously cropped soil on Andrographis paniculata seed germination

3　讨论

化感作用是植物争夺土壤中的养分、空间及竞争生态位而形成的对外界环境的一种适应机制［14］。植物的化感作用是植物通过向环境释放次生代谢产物即化感物质而实现的。化感作用在药用植物连作障碍中的表现尤为显著，人参［15］、丹参［16］、地黄［17］、三七［18］等都具有化感作用。药用植物的化感作用不仅表现在种间，种内的自毒效应也非常强烈，化感自毒是导致药用植物连作障碍的重要因素之一［19］。

李明等［9］研究表明：穿心莲根部及茎叶水浸液对萝卜等植物的种子萌发均有化感抑制效应，并抑制幼苗的生长。张庚［10］发现穿心莲不同部位水浸提液对白菜和生菜幼苗生长具有化感抑制作用，同时穿心莲水浸提液对穿心莲有自毒作用，可抑制其种子的萌发。曾令杰等［11］研究表明正茬穿心莲根际土壤浸提液及穿心莲内酯均能显著抑制三叶鬼针草和穿心莲种子的萌发，且其抑制作用随着浓度的增大而增强；同时，经检测发现穿心莲内酯为根际土壤浸提液中的主要成分。以上研究结果均表明了穿心莲的营养体及正茬土壤均有较强的化感自毒作用，抑制自身及其他植物种子萌发。

本研究就穿心莲连作土壤的水提物及醇提物对其种子萌发的化感作用进行了研究，结果表明：各连作年限（0、1、2年）的穿心莲土壤水、醇提取物均对穿心莲种子的发芽率、发芽指数、发芽势及胚根长度产生了不同程度的化感抑制作用，但抑制效果与连作年限无明显关联。各年限组别中，125 mg/mL水提物的化感综合效应均最大，抑制效果最强。而同一质量浓度的3个连作年限的土壤水提物对穿心莲种子萌发的抑制效果比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。高浓度土壤醇提物对穿心莲种子的抑制作用更强（P＜0.05）。其中，土壤醇提物对发芽种子的胚根长度抑制效果最明显，与对照组比较，在低浓度下差异就有统计学意义（P＜0.01）。

笔者推测，穿心莲存在较强化感作用，这可能是与其主要成分二萜内酯和黄酮类化合物为强化感物质有关。穿心莲植株在生长过程中向土壤中分泌释放了化感物质，使得正茬乃至连作1年及2年的土壤提取物有较强的化感作用，因此化感作用可能是造成或加重穿心莲连作障碍的一个原因。但其连作障碍的具体机制还有待进一步结合穿心莲的生理生态、土壤微生物谱系和丰度变化等方面的研究来阐释。

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【责任编辑：黄玲】

Allelopathy of Continuously Cropped Soil Extracts on Andrographis paniculata Seed Germination

LI Junren1，CHEN Xiuzhen1，LIU Kaipin2，PENG Qiuju2，ZHAN Ruoting1，HE Rui1
（1.Research Centre of Chinese Herbal Resource Science and Engineering，Guangzhou University of Chinese Medicine，Ministry of Education Key Laboratory of Chinese Medicinal Resource from Lingnan，Joint Laboratory of National Engineering Research Center for the Pharmaceutics of Traditional Chinese Medicines，Guangzhou 510006 Guangdong，China；
2.College of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China）

Abstract：Objective To study the allelopathy of continuously cropped soil extracts on the germination of Andrographis paniculata seeds.Methods Different concentrations of water extracts and methanol extracts of 0-，1-，and 2-year soil samples continuously cropped with Andrographis paniculata were prepared and applied for the seed germination test.Results The water extracts and methanol extracts of the soil samples both had inhibitory effect on the germination indexes，germination potential，germination rate，and radicle length of Andrographis paniculata seeds in various degrees，the inhibitory effect being not relevant with continuously cropping years（P＞0.05）.The inhibitory effects of 125 mg/mL of water extracts and high concentration of methanol extracts were strongest，and the high-concentration methanol extract had significant inhibitory effect on radicle length.The allelopathy index（RI）and synthesis effect（SE）index of the seeds treated with water and methanol extracts were less than zero.Conclusion The extracts of continuously cropped soil have allelopathic inhibitory effects on the germination of Andrographis paniculata seeds，which is thought to be one of the main reasons of continuous cropping obstacle of Andrographis paniculata.

Key words：Andrographis paniculata/growth and development；extract of continuously cropped soil；seed germination；allelopathy

中图分类号：R282.2

文献标志码：A

文章编号：1007-3213（2016）03 - 0389 - 07

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03．025

收稿日期：2015-12-07

作者简介：李俊仁（1989-），男，硕士研究生；E-mail：leejunren@163.com

通讯作者：何瑞，女，博士，研究员；E-mail：ruihe@gzucm.edu.cn

基金项目：国家重大科技专项（编号：2012ZX09304006）；广东省协同创新中心创新科研团队建设项目（编号：A1-AFD01514A04）；广州中医药大学“薪火计划”资助项目（编号：XH20140119）