绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk /GCV系统重组慢病毒载体的构建及活性检测

黄暨生，张广献，谭宇蕙，易华，罗惠，杜标炎

（广州中医药大学基础医学院，广东广州　510006）



绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk /GCV系统重组慢病毒载体的构建及活性检测

黄暨生，张广献，谭宇蕙，易华，罗惠，杜标炎

（广州中医药大学基础医学院，广东广州510006）

摘要：【目的】构建绿色荧光蛋白（GFP）示踪的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶基因（HSV1-tk）的重组慢病毒载体，并检测该系统对人皮肤黑色素瘤细胞株A375的感染活性。【方法】构建含有HSV1-tk、GFP融合基因的重组慢病毒表达载体pLV-tk-GFP，并使用限制性内切酶消化进行鉴定及序列测定；用该重组质粒与辅助质粒共转染包装细胞HEK293T，获得重组活病毒并感染A375，以嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株；使用荧光显微镜观察GFP基因的表达，更昔洛韦（GCV）杀伤实验验证tk-GFP基因的活性。【结果】重组质粒pLV-tk-GFP经限制性酶切鉴定和DNA序列测定分析显示，tk基因已连接到载体正确位置，序列无突变；包装病毒并感染细胞后，荧光显微镜下观察显示tk-GFP基因在A375中表达；筛选得到稳定表达细胞株A375/ tk-GFP，GCV能显著杀伤A375/tk-GFP细胞，表明tk基因活性正常。【结论】成功构建了重组pLV-tk-GFP慢病毒载体，该载体能包装产生活病毒且在感染的人黑色素瘤细胞株A375中tk-GFP具有生物活性。

关键词：单纯疱疹病毒1型胸苷激酶基因；自杀基因系统；慢病毒；黑色素瘤

肿瘤自杀基因疗法由于存在旁观者效应，成为肿瘤生物治疗中活跃的研究领域之一。单纯疱疹病毒1型胸苷激酶/更昔洛韦（HSV1-tk/GCV）自杀基因系统是最早进入临床试验的自杀基因系统，在多种肿瘤（如白血病、神经胶质瘤、膀胱癌、肝癌、结肠癌和口腔癌等）的治疗中均显示了一定的抗肿瘤效果［1］。本课题组前期研究了多种肿瘤自杀基因治疗及中药方药对肿瘤自杀基因治疗的增效作用及增效机制［2-5］，但研究工作多以动物肿瘤细胞株为主，且以逆转录病毒介导HSV1-tk，而慢病毒具有更高的转染效率。故本研究通过构建tk-绿色荧光蛋白（GFP）融合基因的重组慢病毒表达载体并转染到人皮肤黑色素瘤细胞A375中，建立绿色荧光示踪的重组HSV1-tk-GFP/GCV系统，作为自杀基因旁杀伤效应直观量化的检测模型，为后续的中药方药对人源性肿瘤细胞的自杀基因治疗增效作用及作用机制的体内外研究奠定基础，现报道如下。

1　材料和方法

1.1载体、细胞株质粒CD511B作为过表达载体，长度为7 544 bp，含人EF1启动子和GFP基因，带有氨苄原核抗性基因、嘌呤霉素筛选标记以及BamH I和EcoR I的酶切位点，由本室保存；大肠杆菌E.coli DH5α菌株由本室保存；人胚肾细胞HEK293T、人皮肤黑色素瘤细胞株A375，为本室保存，均培养于含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，在37℃和体积分数5%CO2的条件下。

1.2药物及试剂嘌呤霉素（美国Amersco公司）；多聚阳离子（美国Polybrene公司）；更昔洛韦（GCV）、四甲基偶氮唑盐（MTT）（美国Sigma公司）；DMEM高糖培养基、Opti-MEM培养基、2.5 g/L胰酶（美国Gibco公司）；胎牛血清（以色列BI公司）；限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ，T4 DNA连接酶（上海晶美生物工程有限公司）；普通小量提取质粒DNA试剂盒（美国Omega Bio-Tek公司）；B型超纯小量提取质粒DNA试剂盒（北京博大泰克生物基因技术有限公司）；DNA凝胶回收试剂盒（DNA Extration Kit）（立陶宛MBI公司）；逆转录和PCR所需试剂（北京Trans Gen公司）；LipofectamineTM2000转染试剂（美国Invitrogen公司）。

1.3仪器UnoⅡThermocycler PCR BiometraR仪（美国MJ Research公司）；Thermo-Forma CO2培养箱（美国Hepa Filter公司）；IX71-F22FL/PH型荧光倒置显微镜及图像采集系统（日本Olympus公司）；台式高速低温离心机（德国Eppendorf公司）；680型酶标仪、小型垂直电泳仪（美国Bio-Rad公司）；细胞培养板等耗材（美国Corning公司）。

1.4重组慢病毒载体构建

1.4.1构建方案目的基因tk序列来自NCBI的Genebank数据库（GenBank：JX392980.1），长度约1 149 bp（R4312），基因片段两端含BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位点。将质粒CD511B经BamHⅠ/ EcoRⅠ双酶切后经琼脂糖凝胶电泳回收获得载体大片段。将目的基因tk与载体大片段均经连接反应后（CD511B-R4312）转化感受态细菌，获得并鉴定转化子。

1.4.2PCR反应以HEK293T细胞总RNA为模板，用高保真酶将目的基因tk片段扩增后进行胶回收，扩增引物：上游5’-ATATCTTGTGGAAAG GACG-3’，下游5’-CTGCATTCTAGTTGTGGTT-3’；DNA片段扩增条件：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸80 s，共进行30个循环后，72℃再延伸10 min。取产物8 μL加入DNA上样缓冲液，混匀后点样至含Goldview （50 μL/L）的10 g/L琼脂糖凝胶，在TAE电泳缓冲液中电泳，鉴定RT-PCR产物。

1.4.3DNA片段回收、连接将限制酶酶切后的载体DNA片段及RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切取DNA条带，以琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，溶于无菌水中－20℃保存。在无菌的Eppendorf管中加入下列成分并进行连接反应：目的DNA片段（1∶50稀释）15 μL，载体DNA片段2 μL，加入2 μL 10×连接缓冲液，1 μL T4 DNA连接酶，总反应体系为20 μL。16℃连接（于冰上操作）过夜后，取10 μL连接产物转化大肠杆菌DH5α。

1.4.4重组克隆筛选、鉴定将转化后的大肠杆菌DH5α接种于氨苄抗性（100 μg/mL）的LB培养基中，37℃、250 r/min振摇过夜。并进行细菌质粒DNA抽提，然后以BamHⅠ/EcoRⅠ酶切进行鉴定，DNA片段电泳并回收。

1.4.5序列测定以回收酶切重组质粒的DNA片段为测序模板，采用通用测序引物，取部分保种的菌液送上海英骏生物技术公司测序。

1.5包装细胞的转染和重组活病毒的收集病毒包装：人胚肾细胞HEK293T，培养于含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养液中，置37℃、体积分数5%的CO2培养箱内培养。铺板2 d后密度达90%左右，转染前1 h，更换4 mL的opti-MEM培养基。参照LipofectamineTM2000转染试剂说明书，将构建好的重组慢病毒质粒pLV-tk-GFP与包装质粒共同转染HER293T细胞，转染6～8 h后换10 mL新鲜培养基沿皿壁缓慢加入。加入新鲜培养基48、72 h后分别收病毒液，离心过滤分装到1.5 mL EP管中，置于-80℃低温冰箱中保存。

1.6人黑色素瘤细胞A375的感染和重组基因的活性鉴定

1.6.1A375细胞感染及稳定表达株的筛选A375为贴壁细胞，培养于含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养液中，置37℃、体积分数5%的CO2培养箱内培养。细胞达到80%～90%的汇合率时，消化细胞并计数，将细胞悬液稀释为5×105/ mL，吸1 mL细胞悬液到2 mL EP管，再加入2 μL polybrene混匀，加入1 mL病毒液充分混匀后接种到培养皿。24 h后更换含0.5 mg/L嘌呤霉素筛选培养液，48～72 h后置于荧光显微镜，蓝光下观察荧光蛋白的表达。隔天换液，维持嘌呤霉素筛选浓度1周。

1.6.2A375/tk-GFP稳定表达株的tk活性检测将A375和A375-tk-GFP按3 000个/孔细胞接种到96孔板，待细胞贴壁生长后，加入GCV，换含终浓度分别为0、6.25、25、100 μmol/L的GCV培养液，GCV作用72 h后镜下观察细胞的变化。采用MTT法检测各组细胞的吸光度（D）值，按公式p细胞存活率（%）=（D测定组/D对照组）×100%，计算各组细胞存活率，比较A375细胞和A375/tk-GFP细胞对GCV的敏感性。用Calcusyn 2.0软件计算半数抑制量（IC50）。

1.7统计方法用SPSS 19.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用两独立样本均数的t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1重组质粒的构建重组慢病毒质粒pLV-tk-GFP分子量约为10.0 kb，酶切后经琼脂糖凝胶电泳条带位置与预期相符，证明目的基因已经成功连接到载体质粒，结果见图1。重组慢病毒载体pLV-tk-GFP基因序列的测序结果与原始载体序列比对，相应序列100%完全一致，结构示意图见图2，证明携带目的基因HSV1-tk的质粒pLV-tk-GFP构建成功。

重组质粒pLV-tk-GFP的测序结果表明目的基因tk序列与GenBank：JX392980.1的一致，没有突变。

2.2包装细胞的转染、重组病毒感染A375和基因表达观察将包装细胞产生的重组慢病毒pLV-tk-GFP感染A375细胞48 h后于荧光倒置显微镜下观察，到绝大部分细胞能被激发出绿色荧光，说明转染率接近100%。用0.5 mg/L嘌呤霉素维持筛选浓度2周，最终获得重组基因整合到染色体上的稳定表达细胞株，命名为A375/tk-GFP，结果见图3。

图1　pLV-tk-GFP质粒酶切结果Figure 1 Enzyme-cut result of plasmid pLV-tk-GFP

图2　重组慢病毒质粒pLV-tk-GFP的结构示意图（R4312为目的基因）Figure 2 Structure delineation for constructed recombinant plasmid pLV-tk-GFP（target gene R4312）

2.3GCV细胞毒性试验验证重组细胞株中整合染色体上的tk-GFP活性对A375细胞、A375/tk-GFP细胞进行不同浓度GCV（0、6.25、25、100 μmol/L）杀伤试验，采用MTT法检测GCV作用72 h的细胞存活率，图4结果显示：A375/tk-GFP组对6.25 μmol/L GCV的敏感性已显著高于A375组，GCV各浓度2组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图5、图6结果显示：A375/tk-GFP细胞生存率随GCV浓度增大逐步减小，GCV作用72 h均见细胞生长受到抑制，细胞膨大变圆，胞膜皱缩，大量细胞脱落悬浮，并有大量细胞碎片产生。GCV 对A375/tk-GFP细胞作用72 h的IC50为6.113 μmol/L。而GCV作用于A375细胞时各浓度组细胞生长良好，与对照组比较细胞密度和存活率无显著差异。

图3　稳定表达绿色荧光蛋白的人黑色素瘤细胞株A375/tk-GFPFigure 3 Human cutaneous melanoma cell line A375/tk-GFP with green fluorescence

图4　A375和A375/tk-GFP细胞对GCV的敏感性（72 h）（±s，N=3）Figure 4 Comparison of the sensitivity of A375 & A375/ tk-GFP cells to GCV（72 h）

图5　不同浓度GCV对A375细胞的杀伤作用（72 h）（×200）Figure 5 The antitumor effects of various concentrations of GCV on A375 after culturing for 72 h（×200）

图6　不同浓度GCV对A375/tk-GFP细胞的杀伤作用（72 h）（×200）Figure 6 The killing effects of various concentrations of GCV on A375/tk-GFP after culturing for 72 h（×200）

3　讨论

针对各种恶性肿瘤的基因治疗临床试验方案占了全球批准进入临床试验阶段基因治疗方案总数的2/3。肿瘤基因治疗的原理是通过将一段具有外源功能的基因采用基因转移技术导入至肿瘤细胞补偿其基因缺失，使其获得特定功能，继而达到抑制或杀伤肿瘤细胞的目的［6］。目前主要的基因导入的常见方法有病毒载体和非病毒载体系统，其中借助以病毒为基础的载体是常见方法之一，包括逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒、慢病毒等［7-8］，而非病毒载体包括质粒DNA、阳离子脂质体、PEI、纳米胶束等［9-10］。病毒载体转染率大大高于非病毒载体。与其他2种载体比较，逆转录病毒载体只能感染分裂期细胞，而且容纳外源基因片段有限，腺病毒载体不能整合到染色体上，只适合瞬时感染；慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷I型病毒（HIV-1）为基础发展起来的，对分裂细胞和非分裂细胞均具有高效的感染性，容纳外源基因片段大且可将外源基因有效地整合到宿主染色体，达到持久稳定表达外源基因的目的，非常适合于较大的融合基因过表达稳定细胞株的建立［11-12］。由于慢病毒载体具有以上众多的优势，其在基因治疗的应用最早始于20世纪70年代，在RNA干扰、自杀基因及免疫基因等基因治疗策略实现外源基因的高效导入，具有良好应用前景并得到广泛应用。本研究通过构建新的重组慢病毒载体pLV-tk-GFP，通过与包装质粒共转染包装细胞能产生活病毒，再感染肿瘤细胞能构建各种重组tk-GFP的肿瘤细胞株，利用其高效转染效率及可示踪特点用于自杀基因治疗以及药物包括中药对其增效作用的研究开发，也可以把它作为一种示踪工具用于研究肿瘤的发病机制及其他药理研究等。

免疫基因治疗、肿瘤抑制基因治疗、自杀基因治疗等基因治疗策略中，自杀基因治疗是将无毒的前体药物转化为有毒性的药物从而产生基因的特异性杀伤作用［13］，同时还可以通过旁观者效应（bystander effect）引起导入自杀基因的肿瘤细胞邻近无自杀基因的肿瘤细胞死亡［14］。HSV-tk/GCV系统在人体试验中获得成功，并已经开展III期临床相关试验研究［15］。治疗恶性黑色素瘤最常见的自杀基因系统是HSV-tk/GCV系统，本课题组前期以逆转录病毒介导构建了绿色荧光示踪、自杀基因阳性的小鼠黑色素瘤细胞B16/tk-GFP以及红色荧光示踪、自杀基因阴性的B16-RFP。通过这一自杀基因旁杀伤效应直观、量化的分析检测模型［16-18］，分析了中药丹参酮IIA等中药对自杀基因的增效作用及旁杀伤效应机制［19］。在此基础上，本研究建立了更高转染效率的重组慢病毒载体pLV-tk-GFP，可用于更多肿瘤株的研究，而获得的A375/tk-GFP细胞株可用于后续的人源性恶性黑色素瘤的自杀基因治疗，以及中药方药增效作用和机制的体内外研究工作。

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【责任编辑：黄玲】

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Construction of Recombinant HSV1-tk/GCV Green Fluorescent Protein Monitoring Lentivirus System and Detection of Its Activity

HUANG Jisheng，ZHANG Guangxian，TAN Yuhui，YI Hua，LUO Hui，DU Biaoyan
（School of Fundamental Medical Science，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China）

Abstract：Objective To construct recombinant herpes simplex virus type 1 thymidine kinase/ganciclovir（HSV1-tk/GCV）green fluorescent protein（GFP）monitoring lentivirus system，and to examine the activity of package cells transfected with the constructed lentiviurs vector and infected with human cutaneous melanoma cell line A375.Methods The recombinant lentiviurs vector pLV-tk-GFP expressing suicide gene HSV1-tk and GFP gene was constructed，and then was identified by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing.After the recombinant plasmid and packaging plasmid were cotransfected to packaging cell line HEK293T，the animated virus was obtained and was used to infecting A375 to screen cell line with stable expression by puromycin.A standard fluorescence microscope was used for florescent detection，and the tk-GFP gene activity was evaluated by GCV anti-tumor effect.Results The results of restriction endonuclease digestion and DNA sequencing showed that tk gene had been successfully inserted into the correct position of the recombined plasmid pLV-tk-GFP，showing no sequence mutation.After A375 cells were infected with the packaging virus，tk-GFP gene expression was present under fluorescence microscope，indicating that cell line A375/tk-GFP was obtained.GCV had obvious killing effect on cell line A375/tk-GFP，indicating that tk gene activity was normal.Conclusion The recombinant lentivirus vector pLV-tk-GFP has been successfully constructed，and the vector can produce animated virus and has the bioactivity of tk-GFP gene in the infected human cutaneous melanoma cell line A375.

Key words：herpes simplex virus type 1 thymidine kinase（HSV1-tk）；suicide gene system；lentivirus；melanoma

中图分类号：R739.5

文献标志码：A

文章编号：1007-3213（2016）03 - 0384 - 05

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03．024

收稿日期：2016-01-30

作者简介：黄暨生（1985-），男，博士研究生；E-mail：ziyuanhuang@163.com

通讯作者：杜标炎，男，教授；E-mail：dubiaoyan@gzucm.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金资助项目（编号：81072906）