大桑菊合剂对小鼠迟发型变态反应性肝损伤的影响

徐嘉辉 黄雪君 曾巧煌 蓝燕娇 张晓露 余德钊

摘要：目的 观察大桑菊合剂对小鼠迟发型变态反应性肝损伤的影响，探讨其抗炎免疫的作用机制。方法 采用腹腔注射环磷酰胺处理后，予2，4，6-三硝基氯苯2次外涂腹部皮肤致敏，再经皮肝穿刺攻击造模。实验小鼠随机分为空白组、模型组和中药高、中、低剂量组。中药高、中、低剂量组给予大桑菊合剂灌胃，每日1次，连续7 d。ELISA检测小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平，HE染色观察肝脏组织病理形态。结果 与正常组比较，模型组AST、ALT和TNF-α水平显著升高（P<0.01）；与模型组比较，中药各剂量组ALT、AST和TNF-α水平显著降低（P<0.05，P<0.01，P<0.001）；中药各剂量组较模型组均能减轻肝组织局部炎症浸润与水肿。结论 大桑菊合剂对小鼠迟发型变态反应性肝损伤具有保护作用。

关键词：大桑菊合剂；迟发型变态反应；肝损伤；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.019

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）07-0074-03

Protective Effects of Dasangju Mixture on Liver Injury Induced by Delayed-type Hypersensitivity in Mice XU Jia-hui1， 2， HUANG Xue-jun1， ZENG Qiao-huang1， LAN Yan-jiao1， ZHANG Xiao-lu1， YU De-zhao2 （1. The Second Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Guangzhou 510000， China； 2. Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510000， China）

Abstract： Objective To investigate the protective effects of Dasangju Mixture on the liver injury induced by delayed-type hypersensitivity in mice； To discuss its mechanism of anti-inflammatory-immunity. Methods After enterocoelia intravenous injection of cyclophosphamide was used， 2，4，6-picryl chloride was used twice for exterior coating for skin of abdomen to cause sensation of skin. Then percutaneous transhepatic puncture was used to attack for modeling. Male Kunming mice were randomly divided into blank group， model group， high-， medium- and low-dose treatment groups. The high-， medium- and low-dose treatment groups were given Dasangju Mixture for gavage， once a day for 7 days. ELISA was applied to determine the serum levels of aspartate aminotransferase （AST）， alamine aminotransferase （ALT） and tumor necrosis factor （TNF）-α. Pathological features of liver tissue were observed by HE staining. Results Compared with the blank group， the levels of AST， ALT and TNF-α in the model group increased significantly （P<0.05）； Compared with the model group， the levels of AST， ALT and TNF-α in the high-， medium- and low-dose treatment groups decreased significantly （P<0.05， P<0.01， P<0.001）； Compared with the model group， high-， medium- and low-dose treatment groups can better alleviate topical inflammation infiltration and edema of liver tissue. Conclusion Dasangju Mixture has certain protective effects on the liver injury induced by delayed-type hypersensitivity in mice.

Key words： Dasangju Mixture； delayed-type hypersensitivity； liver injury； mice

药物性肝损害是儿童常见的药物不良反应之一，世界卫生组织个例安全性病例报告数据库中报道，儿童药物肝损害占其他类型的损害1%，常见药物有扑

基金项目：广东省自然科学基金（2014A030313646）；广东省中医药局科技项目（20120108）

通讯作者：余德钊，E-mail：928279647@qq.com

热息痛、红霉素等[1]。肺炎支原体肺炎是儿童社区获得性肺炎常见病之一，其首选药物是大环内酯类药物，如阿奇霉素等[2]。然而，研究表明阿奇霉素序贯治疗小儿肺炎支原体肺炎与药物性肝炎有一定相关性，年龄越小相关性越大[3]。大桑菊合剂是我们的临床验方，其联合阿奇霉素治疗肺炎支原体肺炎能够明显缩短疗程，降低胃肠道及肝损害等不良反应发生率，且能双向调控促炎因子白细胞介素（IL）-6与抑炎因子IL-10，其作用机制与免疫调控相关[4]。为此，我们通过大桑菊合剂对迟发型变态反应（DTH）性肝损伤动物模型丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的作用，观察大桑菊合剂对小鼠DTH性肝损伤的影响，探讨其抗炎免疫的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性昆明种小鼠50只，6～8周龄，体质量16～18 g，广州中医药大学动物实验中心，许可证号SCXK（粤）2013-0034。饲养于（22±2）℃相对恒温环境，湿度60%～80%，自由饮食。

1.2 药物

大桑菊合剂（桑叶3 g，菊花3 g，浙贝母2 g，甘草1 g，黄芩3 g，薄荷 1g，鱼腥草2 g，连翘2 g，青天葵1 g，芦根2 g，桔梗2 g），广州市康源药业有限公司，10 mL/支，批号20141001。

1.3 主要试剂与仪器

2，4，6-三硝基氯苯（PCl，深圳伽马生物有限公司），环磷酰胺（Sigma公司），AST、ALT、TNF-α小鼠ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所）。RAD680酶标仪（美国伯乐），BX51型显微镜（日本奥林巴斯），冷冻高速离心机（Sigma公司）。

1.4 造模

刮去小鼠腹毛，2%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉；经腹腔注射予200 mg/kg环磷酰胺致小鼠免疫抑制。1 d后予1%PCl的乙醇溶液100 μL腹部暴露皮肤致敏，5 d后再次同样致敏，再5 d后，用0.2%PCl的橄榄油溶液10 μL肝内注射，造成PCl-DTH模型。

1.5 分组、给药及处理

实验小鼠随机分为空白组、模型组和中药低、中、高剂量组，每组10只。剂量采取体表面积法估算，中药低、中、高剂量组给予相应剂量大桑菊合剂灌胃，均定容至0.6 mL，高剂量（8.60 g/kg）相当于18岁以上剂量，中剂量（4.30 g/kg）相当于3～18岁剂量，低剂量（2.10 g/kg）相当于3岁以下剂量；模型组与空白组给予等量蒸馏水灌胃。每日1次，连续7 d。末次给药18 h后进行常规麻醉及腹腔采血，4 ℃、3000 r/min离心10 min，取血清后备测。脱颈处死小鼠，取左叶局部病变组织，10%福尔马林液固定备用。

1.6 小鼠肝组织病理形态学观察

取约2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm肝脏局部病变组织进行常规脱水、石蜡包埋，制成切片。HE染色镜下观察肝脏组织形态学变化。参照文献[5]对肝组织病理形态改变进行评价。按病变程度进行计分：0分，轻微改变；1分，轻中度改变；2分，中度改变；3分，中重度改变；4分，重度改变。

1.7 指标检测

于酶标仪波长450 nm处，ELISA测定ALT、AST，于酶标仪波长490 nm处，ELISA测定TNF-α，均严格按照试剂盒说明操作。

1.8 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，组间比较采用t检验或秩和检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大桑菊合剂对小鼠肝组织病理形态的影响

正常组小鼠肝小叶结构清楚，肝细胞索排列整齐，肝细胞轻微水肿，核结构清晰，肝窦正常；模型组小鼠肝细胞弥漫性水肿，胞浆疏松化，胞质色淡，肝细胞点状坏死，散在有炎性细胞浸润；大桑菊合剂高、中、低剂量组均较模型组小鼠肝脏状况明显改善。结果见图1、表1。

2.2 大桑菊合剂对模型小鼠血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶水平的影响

与正常组比较，模型组小鼠血清AST、ALT水平显著升高（P<0.01）；与模型组比较，中药各剂量组小鼠血清AST、ALT水平显著降低（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。结果见表2。

2.3 大桑菊合剂对模型小鼠血清肿瘤坏死因子-α水平的影响

与正常组比较，模型组小鼠血清TNF-α含量显著升高（P<0.01）；与模型组比较，中药各剂量组小鼠血清TNF-α含量显著降低（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。结果见表3。

正常组 模型组 中药低剂量组

中药中剂量组 中药高剂量组

图1 各组小鼠肝组织病理形态（HE染色，×200）

3 讨论

PCl-DTH小鼠动物模型是由活化的CD4+T细胞介导实验性肝损伤模型[6]。同时，相关细胞因子如IL、TNF-α起重要的调节作用；其中，TNF-α剂量依赖性地促进抗原攻击18 h后T细胞的黏附能力，并且这种促进作用明显高于对脾总淋巴细胞的作用；T细胞与细胞外基质间的黏附能力受细胞因子的调节而上升可能是DTH初期的细胞病理学特征之一。

实验结果表明，大桑菊合剂能明显改善肝细胞局部炎症浸润水肿，既可以显著降低血清ALT、AST水平，又能减少Th1型细胞因子TNF-α含量，提示其可能对Th1细胞介导的DTH初期具有调节的作用。

大桑菊合剂由桑叶、菊花、浙贝母、甘草、黄芩、薄荷、鱼腥草、连翘、青天葵、芦根、桔梗等中药经乙醇提取制成，为古方桑菊饮加减而得，长期运用于治疗儿童呼吸道疾病。方中黄芩有效成分黄芩苷具有抗炎抑菌、抗病毒、清除自由基以及抗肿瘤等作用，且能对肝脏和免疫系统起到保护作用[7]；连翘有效成分连翘苷元对四氯化碳诱导大鼠急性肝损伤具有保护作用，能够明显降低血清TNF-α、IL-8水平[8]。另外，我们前期研究表明，大桑菊合剂具有明显的抗炎抑菌作用，联合阿奇霉素治疗肺炎支原体具有显著疗效；同时能够明显降低Th2细胞因子IL-6与IL-10的血清浓度水平[4]。另有研究表明，IL-6在变态反应性肝损伤初期作用并不明显；TNF-α可诱导IL-6的合成，IL-6则抑制TNF-α的产生，两者是肝脏再生的早期信号[9]。

由此可见，大桑菊合剂不仅具有护肝的作用，其还能通过动态调节Th1/Th2平衡漂移机制起到抗炎免疫的作用。其在肺炎支原体肺炎治疗中，初期通过平衡Th1细胞因子水平，既能减轻肝损伤，又能起到抗炎的效果；后期通过平衡Th2细胞因子水平，使Th1/Th2趋于稳定，从而达到提高联合阿奇霉素治疗肺炎支原体肺炎的作用，但其具体信号通路仍待进一步探讨。

参考文献：

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[2] 余德钊，徐嘉辉，王利.小儿支原体肺炎诊断及中西医治疗研究[J].吉林中医药，2014，34（8）：815-818.

[3] 游思平，戴志辉.阿奇霉素序贯治疗小儿支原体肺炎与药物性肝炎的相关性研究[J].中国现代药物应用，2010，4（16）：34-35.

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[8] 冯芹，夏文凯，王现珍，等.连翘苷元对四氯化碳大鼠急性肝损伤的保护作用[J].中国药理学通报，2015，31（3）：426-430.

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（收稿日期：2015-10-30）

（修回日期：2015-11-27；编辑：华强）