贵州马铃薯炭疽病的诊断及病原鉴定

蒋 颖，吴石平，陈小均＊

（1.遵义市农委，贵州遵义563000；2.贵州省植物保护研究所，贵州贵阳550006）

植物保护·土壤肥料·微生物

贵州马铃薯炭疽病的诊断及病原鉴定

蒋 颖1，吴石平2，陈小均2＊

（1.遵义市农委，贵州遵义563000；2.贵州省植物保护研究所，贵州贵阳550006）

为准确鉴别马铃薯炭疽病症状及病原菌种类，采用形态学观察、ITS序列分析鉴定和分子系统学相结合的方法对贵州省内马铃薯炭疽病病株进行病原菌的分离与鉴定。结果表明：该病原菌为球炭疽菌（Colletotrichum coccodes）。目前，在省内是首次对该病原进行准确鉴定和报道。

马铃薯炭疽病；诊断；病原鉴定；贵州

马铃薯（Solannm tuberosumL）是贵州省重要粮经作物，全省马铃薯种植面积约66.66万hm2，仅次于水稻和玉米，在贵州农业生产中占重要地位。马铃薯炭疽病又称黑点病，是由半知菌亚门真菌球炭疽菌〔Colletotrichum coccodes（Wallr.）Hughes〕侵染引起，主要通过种薯和土壤传播，能够侵染马铃薯的块茎、根、根茎部和叶片。在包括中国在内的世界50多个国家均有发生［1－2］。该病是马铃薯种植区的一种具毁灭性且普遍发生的病害，条件适宜时迅速繁殖并大面积传播。Tsror等［3－4］研究发现，该病对马铃薯产量及品质影响极大，可致减产22%～30%。近年来，由于引种导致国内部分地区发现与该病害相似的疑似病。为此，笔者采用形态学观察与ITS序列分析鉴定相结合的方法对贵州省内部分县市马铃薯不同品种的马铃薯炭疽病疑似病株进行病原菌的分离与鉴定，以期准确识别并为该病害防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 病株 马铃薯品种为费乌瑞它，其病株采自修文县扎佐镇和威宁县麻乍乡。

1.1.2 试剂75%酒精、1%次氯酸钠溶液、PDA培养基、PDB培养基、液氮、无菌水、OMEGA柱式真菌DNA提取试剂盒，硫酸链霉素。

1.1.3 仪器与设备TOMY SX－500型高压蒸汽灭菌器、科伟DNP－9052电热恒温培养箱、BIORAD C1000型PCR仪、水浴锅、Thermo离心机、培养皿（d＝90mm）、三角瓶。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离培养 将田间感病的马铃薯植株采回洗净后，将根茎部先后用75%酒精和1%次氯酸钠溶液表面消毒1min和3～5min，无菌水洗3次后切取小块置于PDA（加入3mg／kg的硫酸链霉毒素霉抑制细菌）培养基上28℃黑暗培养，3～5d后在菌落边缘挑取菌丝进行纯化备用［5］，菌株编号为GZIPP2.1001和GZIPP2.1002。

1.2.2 病原菌的回接与再分离 回接试验将采取菌土法和灌根法进行。1）菌土法。用麦麸固体培养基在三角瓶培养出大量的病原微菌核后，将培养物与土壤混匀，混菌比例为5g／100g干土，将马铃薯的块茎种植在菌土中。2）灌根法。将病原菌菌块转接于装有PDB培养基的三角瓶中，置于250r／min的摇床上培养，待产生大量的黑色微菌核后，用此培养液对马铃薯植株进行灌根，10mL／株。2种处理方法分别接种马铃薯10株，另设空白对照10株。待马铃薯植株感病后对病原进行再次分离验证。

1.2.3 病原菌的形态特征观察 将对再次分离纯化后的病原菌接种到PDA上置于28℃培养，逐日观察并记录其形态特征，并测量分生孢子盘和分生孢子的大小。

1.2.4 病原菌的分子生物学鉴定1）DNA基因组提取。在PDB中进行培养并收集菌丝体，取0.1g菌丝于液氮中迅速研磨成粉末，然后快速转移至1.5mL离心管中，并按OMEGA柱式真菌DNA提取试剂盒说明书的操作步骤进行。2）PCR产物扩增。采用多聚核苷酸链式反应（PCR）的方法扩增核糖体RNA内转录间隔区（ITS）基因，ITS基因扩增使用的引物为V9G［6］和ITS－4［7］。PCR产物由北京诺塞基因有限公司进行测序。

1.3 数据统计与分析

对测序结果在核酸序列数据库GenBank （http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）中进行序列搜索，比较测试菌株与数据库中相应序列的同源程度。并结合病原菌的形态学观察及致病性测定，最终确定病原菌种类。

2 结果分析

2.1 病原菌的形态特征

分离与再分离的菌株形态特征极为相似。病原菌在PDA平板生长较为缓慢，24h、48h、72h和96h菌落直径分别为1～2mm、16～18mm、30～32mm和38～41mm。菌落圆形，边缘整齐，菌丝最初为白色，逐渐变成肉红色，最终变成黑色。72h后在菌落4mm处开始产生微菌核。培养1周后，这些黑色微菌核密集形成块状的菌核布满整皿（d＝90mm），有时呈扇型分布。在这些微菌核上聚生着黑色分生孢子盘（图1），在分生孢子盘上着生有隔的刚毛，黑褐色。分生孢子长椭圆形或纺锤形，中间部有缢缩，平均大小为5.575μm×19.85μm，2个油球在孢子的两端。形态与魏周全等［8］的研究结果基本一致。因此，初步鉴定为C.coccodes。

图1 马铃薯炭疽病的田间症状及病原特征Fig.1 Field symptom and pathogeny characteristics of potato black dot

2.2 病原回接后植株的发病症状

2种方法接种均能使植株感病，空白对照生长正常，无任何病症。感病后的马铃薯植株顶部叶片开始变黄、随之扩展到中部和基部，甚至整株死亡；根茎部变黑至腐烂，湿度较大时在根茎部及内腔产生大量点状黑色的菌核，经显微观察，这些小黑点上着生刚毛。与田间的症状表现一致。

2.3 病原菌的分子生物学鉴定

将扩增产物测序所得序列与GenBank中核酸数据进行Blast分析的结果（图2）表明，该序列与已报道的C.coccodes序列同源性最高，相似性达99%。通过分子系统学分析，在马铃薯病株上分离的2个菌株GZIPP2.1001和GZIPP2.1002与模式菌株C.coccodes CBS369.75和C.coccodes CPOS1聚在一支，支持率为99%。并与近缘种C.liriopes CBS122747、C.liriopes CBS119444、C.spaethianumCBS102642和C.spaethianumCBS167.49形成姊妹支，支持率为99%。因此，从分子系统学的角度确定该分离物为球炭疽菌（C.coccodes）。

图2 马铃薯炭疽病病原菌及相关菌株的分子系统树Fig.2 Polygenic molecular phylogenetic tree of pathogenic bacteria of potato black dot and related strains

3 结论与讨论

1）综合病原菌形态特征、回接植株发病症状和分子生物学鉴定技术，确定该病原菌为球炭疽菌（C.coccodes）。目前，在贵州马铃薯主栽区均有该病害的发生，可能发展成为马铃薯的一种主要真菌性病害，应引起重视。

2）马铃薯炭疽病田间表现症状多样，从根、地下茎和匍匐茎的腐烂，到地上部叶片的变黄和萎蔫，该症状极可能与其他病原菌引起的土传病害症状相混淆。如，叶片发黄至枯萎症状与轮枝菌黄萎病和镰刀菌枯萎病相似；地下茎和匍匐茎上的病斑也与马铃薯丝核菌相类似。因此，应加强对该病害症状识别、病原诊断和传播途径的了解。

3）马铃薯炭疽病在1997年发布的“中华人民共和国进境植物检疫潜在危险性病、虫、杂草名录（试行）的通知”中被列为具有潜在危害的病害，说明，该病害对马铃薯生产带来的影响极大。因此，在全国各省市应加强对该病害的检疫，避免病害的传播与危害。

4）马铃薯炭疽病的病原主要以微菌核在块茎、作物病残体和土壤中越冬，作为初侵染源很容易进行传播［9］，且该病菌在土壤中存活长达13年［10］，具有潜在危害特性。在防控方面应加强检疫，与其他非茄科作物的轮作时间至少以5年以上，在播种前对土壤进行溴甲烷熏蒸，可以有效降低马铃薯炭疽发病率。

致谢：研究内容在贵州省植物保护研究所植病课题实验室内完成，特此致谢！

［1］Johnson D A，Miliczky E R.Distribution and development of black dot，Verticillium wilt，and powdery scab on Rusot Burbank Potatoes in Washington State ［J］.Plant Dis，1993，77：74－79.

［2］中华人民共和国动植物检疫局.“中华人民共和国进境植物检疫潜在危险性病、虫、杂草名录（试行）的通知”〔动植检植字（1997）33号〕［EB／OL］.（1997－01－01）［2016－04－30］http：／／www.aqsiq.gov.cn／zwgk／flgz／dzwjg／zw／200610／t20061027＿16851.htm.

［3］Tsror（Lahkim）L，Edich O.Hazanovsky M.Effect of Colletotrichum coccodes on potato yield，tuber quality，and stem colonization during spring and autumn［J］.Plant Disease，1999，83：561－565.

［4］Pacliata A，Kerr E D.Blank dot of potato caused by Colletotrichum coccodes in Nebraska［J］.Plant Dis，1992，76：1077.

［5］方中达.植病研究方法［M］.3版.北京：中国农业出版社，1998：124－343.

［6］Hoog G S，Ende A.Molecular diagnostics of clinical strains of filamentous Basidiomycetes［J］.Mycoses，1998，41：183－189.

［7］White T J，Bruns T，Lee S.PCR protocols：aguide to methods and applications［M］.San Diego：Academic Press，1990.

［8］魏周全，陈爱昌，骆得功，等.甘肃省马铃薯炭疽病病原分离与鉴定［J］.植物保护，2012，38（3）：113－115.

［9］Cullen D W，Lees A K，Totll I K，et al.Detection of Colletotrichum coccodes from soil and potato by conventional and quantitalive real－time PCR［J］.Plant Pathology，2002，51：281－292.

［10］Dillard H R，Cobb A C.Survival of Colletotrichum coccodes ih infected tomato tissue and in soil［J］.Plant Disease，1998，82：235－238.

（责任编辑：王 海）

Diagnosis and Identification of Potato Black Dot in Guizhou

JIANG Ying1，WU Shiping2，CHEN Xiaojun2＊
（1.Zunyi Agricultural Commission，Zunyi，Guizhou 563000；2.Guizhou Institute of Plant Protection，Guiyang，Guizhou550006）

In order to provide references for actually identify the symptom and pathogenic bacteria species of potato black dot，the pathogenic bacteria were isolated and identified by using methods of morphological observation，ITS sequence analysis and molecular systematics.Results：The pathogen was Colletotrichum coccodes，which was firstly identified and reported in Guizhou.

potato black dot；diagnosis；pathogen identification；Guizhou

S436.32

A

1001－3601（2016）07－0292－0033－03

2015－05－03；2016－06－14修回

蒋 颖（1980－）男，农艺师，硕士，从事农业技术推广工作。E－mail：89039720＠qq.com

＊通讯作者：陈小均（1979－），男，副研究员，硕士，从事植物病理及防治技术研究。E－mail：240255044＠qq.com