耐苯巴比妥钠及苯妥英钠杏仁核点燃大鼠癫痫模型的制作*

唐太峰, 伍国锋

(1.贵阳市第二人民医院 神经内科， 贵州 贵阳　550081； 2.贵州医科大学附院 神经内科， 贵州 贵阳　550004)

耐苯巴比妥钠及苯妥英钠杏仁核点燃大鼠癫痫模型的制作*

唐太峰1, 伍国锋2

(1.贵阳市第二人民医院 神经内科， 贵州 贵阳550081； 2.贵州医科大学附院 神经内科， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 建立耐苯巴比妥钠(PB)及苯妥英钠(PHT)的杏仁核点燃癫痫模型大鼠的方法。方法： 60只雄性健康SD大鼠制作杏仁核点燃癫痫模型，采用PHT、PB对癫痫大鼠进行耐药筛选，用放电阈值(ADT)来判断癫痫大鼠对PHT和PB的敏感性，以应用PHT或PB前的ADT值为对照(对照值ADT)，用药后ADT波动范围在20%对照值ADT以内为耐药癫痫模型判断标准。结果： 60只大鼠，死亡13只，47只大鼠完成杏仁核点燃实验，点燃癫痫模型大鼠24只，发作强度4～5级，癫痫点燃率51%；PB及PHT筛选出7只耐药的癫痫大鼠，耐药率29.17%；耐药大鼠用药后仍可诱发癫痫发作，用药后ADT波动在20%对照值ADT之内。结论： 利用杏仁核慢点燃癫痫模型大鼠建立的耐药癫痫模型可建立耐药癫痫模型。

[关键词]癫痫; 大鼠，SD; 动物模型； 杏仁核点燃; 耐药; 苯妥英钠; 苯巴比妥钠

癫痫是一种神经系统的常见病, 发病率占总人口的1%～2%，目前仍以药物治疗为主。尽管治疗癫痫的新药不断开发应用，但仍有部分患者对药物的反应效果不佳，出现抗癫痫药物(AEDs)耐药的病例，且机制不明。对癫痫耐药的研究，主要依赖于动物模型，癫痫模型制作主要有化学点燃和电点燃两种方法，前者以药物诱导癫痫发作，但易于被AEDs控制，故不适合建立耐药癫痫模型；而后者与人类癫痫症状学、行为缺陷、对AEDs的反应等方面均很相似，较化学点燃模型更为理想。本研究以电点燃模型为基础，并参照2015年耐药癫痫定义[1]，探讨建立理想耐药癫痫模型的方法。

1材料和方法

1.1动物与仪器

雄性SD大鼠60只，平均体质量(200±50)g，购自贵州医科大学动物实验动物中心。大鼠分笼单独饲养，饲养室安静，保持温度为(20±2)℃，相对湿度60%，光照时间12 h/d，清洁饮水，标准饲养。 主要仪器有BL-420E生物技能实验系统，江湾Ⅱ型脑立体定位仪。

1.2方法

1.2.1刺激电极制备及电极定位将2根直径0.2 mm镍铬漆包线截取适当的长度拧为螺旋状，连接至微型插头，用万用表检测线路连通且无短路，电极长度8.5 mm；4%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，固定于大鼠脑立体定位仪，暴露颅骨及前囟，剥离骨膜，创面止血及骨面干燥，在右侧杏仁基底外侧核的颅骨表面投射点钻孔，按G paxinos 大鼠脑立体定位图谱定位 (前囟后2.0 mm，矢状缝旁开5.0 mm，深度8.5 mm)，将制备好的双极螺旋镍铬电极垂直插入，以502胶水及牙托粉固定于颅骨表面。术后连续3 d腹腔注射青霉素钠(100 000 U/d)预防感染，大鼠术后恢复1周开始电刺激。

1.2.2点燃癫痫模型和记录脑电图每日予杏仁核1次电刺激(细电流，串刺激，波宽1 ms，频率60 Hz，持续时间1 s，强度0.450 mA)，同时记录后发放(after discharge ，AD，即电刺激后高幅多棘波，确认5个以上)；对有AD及抽搐反应大鼠继续每日给予刺激，同时观察发作后的发作强度；对无AD及抽搐大鼠放弃刺激。癫痫发作强度按Racine法分级(表1)，连续3次4～5级以上发作则记为完全点燃，之后不再给予刺激；连续刺激30次以上，仍未达到4～5级发作，或虽曾达到4～5级，但以后发作等级逐渐倒退，则放弃刺激。对癫痫点燃的大鼠，于点燃24 h后测后放电阈值(after discharge threshold， ADT)，ADT是指能引起后发放的最小的电流强度，起始强度定为0.02 mA，此后按每次叠加20%刺激，每5 min记录1次，直至测出后放电波，同时记录脑电图。

表1　杏仁核点燃癫痫模型癫痫发作Racine’s分级

1.2.3药物筛选耐药癫痫模型确定点燃ADT 24 h后，按1.2.2项下方法测定ADT对照值，按苯妥英钠(PHT)75 mg/kg计算注射液体积，以等体积生理盐水腹腔注射，注射后1 h测ADT，起始电流强度为点燃ADT值20%； 24 h后腹腔注射PHT (75 mg/kg)，注射后1 h测ADT(起始电流强度为ADT对照值的20%)；上述步骤连续3次，每次间隔1周。然后用同样方法进行耐25 mg/kg苯巴比妥钠(PB)耐药筛选。耐药判定根据Loscher[2]的评定方法，将ADT对照值与注射PHT或PB后所测得的ADT值对比，若连续3次注射PHT或PB后ADT值在ADT对照值的20%内，且电刺激仍可引起癫痫发作，则判定耐药。

2结果

2.1癫痫模型大鼠点燃情况

60只大鼠，2只置入电极时死亡、3只置入电极1 d后死亡、2只置入电极后3 d后死亡，余下53只给予电刺激，刺激过程中电极脱落6只，最终47只完成点燃过程；成功点燃24只，成功率51%，平均发作天数15 d；模型大鼠癫痫典型发作时，开始出现凝视、点头、眨眼及颈部抽搐甚至全身痉挛，然后双上肢逐渐上抬、直立、跌倒以及全身性强直痉挛发作；其中1只大鼠偶尔有自发性发作，最长持续时间约15 min。刺激过程中还发现，在上一次电刺激引起的AD结束、切换电流方向给予阈下刺激时，还可引出AD或癫痫发作；但上一次电刺激引起的AD结束较长时间以后，用同一方向和强度的电流给予刺激，则不能引出AD或癫痫发作。

2.2脑电图

癫痫点燃大鼠癫痫未发作时的脑电图以散在的α、θ波为主要表现，AD时脑电图主要表现为单个棘波、类棘慢波、多棘波活动，发作时脑电图主要表现为大量高波幅棘波、尖波发放，夹杂棘慢复合波(图1)。

注：a为未发作时脑电图，b为AD时脑电图，c为癫痫发作时脑电图图1　杏仁核点燃癫痫大鼠脑电图Fig.1　EEG in rats of each period

2.3行为学表现

电刺激过程中，予大于ADT的电流强度刺激后，癫痫点燃大鼠明显比未刺激及ADT阈下刺激时表现为烦躁，不易抓获、逃窜、嘶叫， 2只出现撕咬，其中1只发生跳跃攻击；同步脑电图记录可见AD，随着大鼠逐渐安静，脑电图转为平稳。

2.4药物筛选

24只点燃大鼠，应用PHT 3次后，7只通过筛选，ADT值不增高或增高小于20%，且予电刺激后仍可引起癫痫发作； 接着应用PB 3次，7只大鼠全部通过筛选，确定为耐药癫痫大鼠模型，耐药率29.17%。

3讨论

适宜模型的选择是研究癫痫的重要前提。目前癫痫模型主要有遗传模型、化学点燃模型和电点燃模型3类，其中遗传模型因制作复杂且费用昂贵，难以实施，故目前应用最多的为化学点燃模型和电点燃模型，对于普通癫痫的研究，2者均能很好的完成，但对于以何种模型为基础建立耐药癫痫模型更为理想，目前研究尚少，这也是本实验要探讨解决的问题。化学点燃模型种类繁多，常用致痫剂有青霉素、海人酸、匹鲁卡品、马钱子碱、戊四氮、美解眠、荷包牡丹碱、印防己毒素等，目前应用最多的耐药性癫痫动物模型是匹鲁卡品和海人酸模型。化学类模型制作简单方便，且点燃成功率高，可达73%～96%[2-4]。但若作为筛选耐药癫痫的模型，具有发作易于被抗癫痫药物控制；随着时间的推移，癫痫发作行为表现会逐渐倒退[5],不利于长期研究；缺乏可量化的评判指标等缺陷。此外，目前许多耐药癫痫模型只选用一种AEDs进行耐药筛选，而根据耐药癫痫定义的核心[1]，至少对两种或两种以上AEDs耐药才可称为耐药癫痫，故仅用一种AEDs筛选出的耐药模型有所缺陷。

本研究认为理想的耐药癫痫模型应具有以下标准:(1)两种或两种以上AEDs不能控制其癫痫发作；(2)发作类型及对AEDs的反应与人类相似;(3)模型发作时有脑部异常放电，可从电生理角度评价药物疗效；(4)模型稳定且能够长期存活，有利于进行长期研究。而结果表明，电点燃模型筛选出的耐药癫痫模型可很好的符合上述标准。电点燃模型是近来研究的热点，脑内许多部位给予适当电刺激均可引起点燃现象，最经典和常用的是海马和杏仁核，尤以杏仁核敏感性最高[6]。根据刺激方式的不同，电点燃可分为快点燃和慢点燃两种。快点燃，成功率相仿，快点燃时间短，1 d～数d，而本研究所用的慢点燃平均点燃天数15 d。虽然快点燃模型制作更为方便快捷，但是对于研究耐药癫痫来说，仍有其缺陷：(1)发作等级会随时间推移而倒退[5]；(2)病生理改变与慢性癫痫模型有所区别，这提示慢点燃模型较快点燃模型可能更为符合人类的病理生理学改变。并且，慢电点燃模型，一经点燃，稳定性好、持续时间长，短期内不会出现明显的发作等级倒退[7]。相对于化学点燃模型，电点燃模型除了观察发作行为学的改变外，还可根据脑电图、ADT这样可量化的指标来观察发作时的电生理变化，并且可据此进行更为可靠的药物筛选，方便研究。本研究中，采用两种不同作用机制的AEDs进行药物筛选，更加符合临床情况，未出现化学点燃模型中发作易被PB控制的情况；通过观察ADT这一敏感且可量化的指标，能更加直观、客观地进行耐药筛选。本实验耐药率29.17%，与人类患者中的30%左右的耐药率相当[8]，符合临床特点。本方法的缺陷主要在于，相对于化学点燃模型，此方法制作过程较为复杂，且50%左右的点燃率相对较低。

综上所述，本研究通过慢电点燃建立的耐药癫痫模型，相较于其他点燃方法，更为符合耐药癫痫模型所应具有的特点，可更好地进行耐药癫痫的相关研究。

4参考文献

[1] 中国医师协会神经内科分会癫痫专委会. 耐药癫痫定义中国专家共识[J].中国医师杂志， 2015(7)：964-966.

[2] L oscher W，Fassbender CP，Gram L，et al．Determination of GABA and vigabatrin in human plasma by a rapid and simple HPLC method：correlation between clinical response to vigabatrin and increase in plasma GABA[J]．Epilepsy Res， 1993(1):245-255．

[3] 肖霞, 王翠翠, 陈英辉. 粉防己碱对难治性癫痫大鼠行为的影响[J]. 神经疾病与精神卫生, 2011(3): 248-250.

[4] 刘晓英, 伍国锋, 郝勇,等. 抗癫痫药耐药性鼠模型的建立及其P-gp的表达[J].癫痫与神经电生理学杂志, 2011(6): 321-326.

[5] 陈中玮, 周鑫. 3种癫痫模型的制备及应用分析[J]. 贵阳医学院学报, 2015(5): 482-485.

[6] Krishnan P，Chattopadhyay A，Saha M．Periventricular nodular heterotopia，frontonasal encephalocele，corpus callosal dysgenesis and arachnoid cyst：A constellation of abnormalities in a child with epilepsy[J]．J Pediatr Neurosci， 2014(3):273-275．

[7] Wison CL,Maidment NT,Shomer MH,et al.Comparison of seizure related aminoacid release in human epileptic hippocampus versus a chronic kainate rat model of hippcampal epilepsy[J]. Epilepsy Res, 1996(2):245-254.

[8] Kwan P， Arzimanoglou A， Berg AT，et al． Definition of drug resistant epilepsy: consensus proposal by the ad hoc task force of the ILAE commission on therapeutic strategies [J]．Epilepsia， 2010(5):1069．

(2016-03-26收稿，2016-05-12修回)

中文编辑： 潘娅； 英文编辑： 刘华

Construction of Amygdala Kindling Epilepsy Rat Model Resistant to Phenobarbital and Phenytoin Sodium

TANG Taifeng1, WU Guofeng2

(1.DepartmentofNeurology,theSecondPeople'sHospitalofGuiyang,Guiyang550081,Guizhou,China; 2.DepartmentofNeurology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To explore the way for construction of the amygdala kindling epilepsy rat model resistant to phenobarbital (PB) and phenytoin sodium(PHT). Methods: 60 healthy male SD rats were selected to make the amygdala kindling epilepsy model. Amygdala kindling rats were screened by PHT and PB for their drug resistance. After discharge threshold (ADT) was used to estimate their sensitivity to PHT and PB. The criterion of drug resistance epilepsy model was based on the variations of ADT: ADT fluctuation range under 20% of ADT control value. Results: Among the 60 rats, 13 died and 47 rats completed the amygdala kindling experiment. 24 rats were successfully established into amygdala kindling epilepsy rat model, attack intensity 4～5 level and epilepsy kindling rate was 51%. 7 rats with tolerance to phenobarbital sodium (PB) and phenytoin sodium(PHT) were picked, and resistant rate 29.17%. Drug resistant rats could still be induced to seizure of epilepsy, and ADT fluctuation range was under 20% of ADT control value. Conclusion: The amygdala kindling epilepsy rat model with tolerance to phenobarbital sodium (PB) and phenytoin sodium(PHT) can be successfully established.

[Key words]epilepsy; rat，Sprague-Dawley; animal model; amygdala kindling; drug resistance; phenytoin sodium; phenobarbital

[中图分类号]R749.16

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)06-0671-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.012

网络出版时间：2016-06-16网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160616.1727.052.html