大腹园蛛的细胞及遗传生殖毒性研究

韩　旭，高久春，张　欢，万　鑫，李兆东，高元奇，费　瑞

(吉林大学基础医学院，吉林 长春 130021)

大腹园蛛的细胞及遗传生殖毒性研究

韩旭，高久春，张欢，万鑫，李兆东，高元奇，费瑞

(吉林大学基础医学院，吉林 长春 130021)

[摘要]利用小鼠成纤维细胞(L929)研究了大腹园蛛(Araneus ventricosus)的体外细胞毒性；选用健康昆明小鼠，采用灌胃染毒方式进行了精子畸形和骨髓嗜多染红细胞微核实验，研究了大腹园蛛的遗传及生殖毒性.结果表明：大腹园蛛对L929细胞的增殖无影响(P>0.05)；小鼠嗜多染红细胞微核数量和精子畸变数量与空白对照组相比无明显差异(P>0.05)；大腹园蛛焙干粉无细胞毒性，不能影响小鼠的生殖和遗传.

[关键词]大腹园蛛；L929细胞；精子畸形；骨髓嗜多染微核

蜘蛛属于节肢动物门蛛形纲蜘蛛目，除南极洲外全球都有分布.目前，全世界的蜘蛛共有4万多种，而我国有3 000多种，其中一些种类带有剧毒.我国人民对蜘蛛的认识始于《诗经》，而以蜘蛛作为药物早在公元741年的《本草拾遗》中就有记载[1].蜘蛛全身都是宝，且药用价值极高.

大腹园蛛(Araneus ventricosus)属节肢动物门(Arthropoda)、蛛形纲(Arachnida)、蜘蛛目(Araneae)、园蛛科(Araneidae)、园蛛属(Araneus)，是最常见的蜘蛛之一.目前，大腹园蛛在医疗、保健、食品上都有广泛应用.在饮食保健方面，国外有园蛛酱、园蛛口服液，而中国有园蛛羮[1].在医学方面，大腹园蛛同样具有很高的药用价值.据相关资料记载，园蛛成体焙干后可用于治疗背疮、痔疮、阳痿、中风偏瘫、小儿惊风、肾阳亏虚、口噤、疔肿、毒虫咬伤等[2-5].近年来，随着分子生物学的发展，有关蜘蛛毒素的研究也逐渐深入，但有关蜘蛛成体的研究在国内外并不常见，其中有关园蛛成体毒性的研究更未见报道.因此，本文利用小鼠成纤维细胞(L929)研究了大腹园蛛(Araneus ventricosus)的体外细胞毒性，通过嗜多染微核实验和精子畸形实验研究了大腹园蛛体内的细胞毒性.研究结果可为大腹园蛛的进一步开发利用奠定理论和实验基础.

1材料与方法

1.1实验动物

大腹园蛛采自吉林省吉林市冯家屯，使用时用烘箱焙干并制成干粉，滤去残渣.昆明种纯系小鼠，体重18～22 g，雌雄各半，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供，合格证号：吉实动质(2000)042号.实验前在室内常规饲养2 d.

1.2药品与试剂

环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司生产，DMSO)购于吉林大药房；标准胎牛血清购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司；胰酶购自Hyclone公司.其他所用试剂均为分析纯.

2实验方法

2.1细胞毒性实验

取对数生长期的L929细胞接种于细胞培养瓶(25 cm2)，待细胞生长至培养瓶底面的70%～80%后，消化、离心，并接种于 96 孔板，置37℃，含5% CO2的恒温孵箱培养.实验分5组，即：空白对照组、阳性对照组和3种不同质量浓度的大腹园蛛处理组.24 h后取出培养板，分别加入10 μL药物，其中空白对照组加入PBS，阳性对照组加入5%的DMSO，3种不同质量浓度的大腹园蛛处理组分别加入10，20和40 mg/mL的大腹园蛛焙干粉末(AP).将对照组和处理组于37℃，含5% CO2的恒温孵育箱中继续培养24 h，然后取出，每孔加入10 μL CCK8，在37℃，含5% CO2的恒温孵育箱孵育2 h.最后，用酶标仪在450 nm 波长处测各孔D(450)值[6].

2.2小鼠嗜多染红细胞的微核实验

选取小鼠50只，随机分5组，即空白对照组(蒸馏水)；阳性对照组(60 mg/kg环磷酰胺)；2.5，5，10 g/kg的大腹园蛛焙干粉末处理组，每组10只.小鼠每天灌胃染毒一次，灌胃剂量为0.02 mL/g，连续4 d.第5天处死小鼠，取出胸骨，剃净肌肉，除尽血污，横向剪断胸骨，暴露骨髓腔并挤出骨髓.加一滴小牛血清并均匀涂在载玻片上，于室温晾干后放入甲醇固定15 min，取出自然晾干，用Geimsa染色15 min后镜检.每张片计数1 000个嗜多染红细胞，计算出含有微核的嗜多染红细胞微核率[7].

嗜多染红细胞微核率=含微核的嗜多染红细胞数/嗜多染红细胞总数×100%.

2.3小鼠精子畸形实验

选用健康雄性小鼠50只，体重18～22 g，6～8周龄.随机分5组，即：空白对照组(蒸馏水)，阳性对照组(40 mg/kg环磷酰胺)，2.5，5.0，10 g/kg的大腹园蛛焙干粉末处理组，每组10只.小鼠每天灌胃染毒一次，灌胃剂量为0.02 mL/g，连续5 d.第35天脱颈处死小鼠，取两侧副睾剪碎、涂片、染色.在显微镜下观察结构完整的1 000个精子，并根据精子质量标准，记录畸形的精子数目，计算精子畸形率[9，11].

精子畸形率=畸形精子数/精子总数×100%.

3实验结果

3.1大腹园蛛对细胞毒性的影响

大腹园蛛对细胞毒性影响的实验结果如表1所示.阳性对照组(DMSO)细胞的相对增殖率为22%，而10，20和40 mg/mL的大腹园蛛焙干粉处理组的相对增殖率分别为99%，94%和135%，根据细胞毒性反应分级评价标准，阳性对照组为四级毒性，而3个大腹园蛛焙干粉处理组都属于一级毒.

表1　大腹园蛛对L929细胞毒性的影响

3.2大腹园蛛对小鼠嗜多染红细胞微核的影响

各实验组小鼠在给药期间，生长状态均无异常.以2.5，5.0和10 g/kg的大腹园蛛焙干粉分别给小鼠灌胃后，小鼠嗜多染红细胞(PEC)的微核率分别为0.25%，0.26%和0.23%.与空白对照(蒸馏水)组比较，差异不显著(P>0.05)，而与阳性对照(环磷酰胺)组比较，差异极显著(P<0.01)，表明大腹园蛛不能诱发小鼠PEC微核率的增加.具体实验结果如表2所示.

表2　大腹园蛛对小鼠骨髓PEC微核的影响

注：与阳性对照组比较，*表示P<0.01.

3.3对小鼠精子畸形的影响

实验结果如表3所显示.以2.5，5.0和10 g/kg的大腹园蛛焙干粉(AP)分别给小鼠灌胃染毒后，小鼠的精子畸形率分别为2.4%，2.4%，2.7%，与空白对照组相比无统计学差异(P>0.05)，而与阳性对照(环磷酰胺)组相比，具有极显著差异(P<0.01).阳性对照(环磷酰胺)组与空白对照(蒸馏水)组比较，具有极显著差异(P<0.01).表明大腹园蛛焙干粉对小鼠的生殖无致突变作用.

表3　大腹园蛛对小鼠精子畸形影响

注：与阳性对照组比较，*表示P<0.01；与空白对照组比较，#表示P<0.01.

4讨论

近年来，不少国家开始注意昆虫类药物开发.美国盐湖城自然产品公司以蜘蛛为原料已经开发出了很多种新药，而以蜘蛛干品为原料的蜘蛛粉、蜘蛛羹目前也风靡全球，广受人们喜爱.虽然大腹园蛛在中药及饮食保健方面均有应用，但由于其本身是有毒类动物，其毒性大小及对人的毒性反应尚未有报道，这严重阻碍了对其的进一步开发利用.本文从细胞毒性、遗传毒、生殖毒三个角度探究了大腹园蛛的毒性，为大腹园蛛的药物开发应用提供了实验证据.

细胞毒性实验是一类在离体状态下，模拟体内生存环境，检测外来物质接触机体组织后的生物学反应实验.通过体外细胞毒性实验，可以检测供试品接触细胞后，细胞的形态和功能变化，细胞溶解、细胞生长及死亡等毒性反应[6].为评价大腹园蛛对细胞产生的毒性作用，本文选取了对数生长期的L929细胞作为靶细胞，采用国家GB/T14233.2—2005规定的方法进行了检测，结果显示，大腹园蛛毒性反应为一级，不具有细胞毒性成分.

小鼠骨髓嗜多染微核实验是急性毒性常用的一种检测方式，是检测体外物质对染色质损伤的重要方法[7]，能快速、简便地检测染色体损伤.微核实验因其灵敏、稳定，且能检测染色体完整性改变和分离改变，因而在毒理学研究上得到了广泛应用[8].微核实验的目的主要是通过检测哺乳动物骨髓细胞中嗜多染红细胞的微核出现率，间接反映骨髓细胞染色体畸变发生率的高低，从而判断受试物是否具有致突变作用[8-10].本实验结果证实，大腹园蛛的3个剂量组与空白对照组相比均无显著差异(P >0.05)，表明大腹园蛛对小鼠骨髓细胞微核没有影响，无致突变作用.

小鼠精子畸形实验是检测物质是否具有遗传毒性的重要方法.在正常情况下哺乳动物的精液中也可能含有畸形的精子，但在精原细胞后期和精母细胞早期，会对化学诱变剂较为敏感，在此期间给予有毒物可提高精子畸形的突变率，因此可以用检查雄性动物接触化学毒物后精子畸形率的高低变化，判断该化学毒物的生殖毒性和对生殖细胞潜在的致突变性[11-12].本实验的结果证实，大腹园蛛的3个剂量组与空白对照组相比均无显著性差异(P>0.05)，表明大腹园蛛对小鼠的精子无致畸作用.

本文的研究结果证明，大腹园蛛焙干粉末属无毒物，不能影响小鼠的生殖和遗传特征.本研究结果不仅为大腹园蛛今后的药物开发研究提供了理论和实验依据，而且也为其食品开发奠定了实验基础.

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(责任编辑：方林)

The studies of cell and genetic reproductive toxicity of Araneus ventricosus spider

HAN Xu，GAO Jiu-chun，ZHANG Huan，WAN Xin，LI Zhao-dong，GAO Yuan-qi，FEI Rui

(School of Basic Medical Science，Jilin University，Changchun 130021，China)

Abstract:L929 cell was used to study the cytotoxicity in vitro of the Araneus ventricosu spider.Healthy kunming mice were used to study genetic and reproductive toxicity of the spider by micronucleus of bone marrow and sperm abnormality in the way of intragastric gavage..Experimental results showed that Araneus ventricosus spiders had no effect on the proliferation of L929 cell(P>0.05).The micronucleus and the sperm abnormality rate of mice were not significantly different from blank control group(P>0.05).These results showed that the Araneus ventricosus spider is no cytotoxicity and no effect on the reproductive and genetic in mice.These results laid a foundation for the activity study of Araneus ventricosus spider.

Keywords:Araneus ventricosus；L929 cell；sperm abnormality；micronucleus of bone marrow

[文章编号]1000-1832(2016)02-0118-04

[收稿日期]2015-05-27

[基金项目]吉林省自然科学基金资助项目(201215058).

[作者简介]韩旭(1988—)，男，硕士研究生；通讯作者：费瑞(1964—)，男，博士，教授，主要从事多糖及生物活性物质功能研究.

[中图分类号]R 996.3[学科代码]350·20

[文献标志码]A

[DOI]10.16163/j.cnki.22-1123/n.2016.02.025