葶苈子水提液对内毒素致急性肺损伤大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞水通道蛋白5表达的影响*

张朝晖　徐小云　瞿星光　邹文博　李灵丰　曾超　姚玲　钟建华（三峡大学第一临床医学院，湖北省宜昌市中心人民医院，湖北　宜昌　443003）



葶苈子水提液对内毒素致急性肺损伤大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞水通道蛋白5表达的影响*

张朝晖徐小云△瞿星光邹文博李灵丰曾超姚玲钟建华
（三峡大学第一临床医学院，湖北省宜昌市中心人民医院，湖北宜昌443003）

【摘要】目的观察葶苈子水提液对内毒素致急性肺损伤大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞水通道蛋白5表达的影响。方法清洁级SD大鼠18只，随机分成空白对照组、模型组、葶苈子治疗组（治疗组）共3组，尾静脉注射内毒素建立急性肺损伤模型后4 h处死大鼠。计量24 h尿量，收集血液样本，测定血气分析，摘取肺脏，称重并计算肺系数，HE染色法观察肺组织病理，并采用免疫电泳法测定通道蛋白5（AQP5）的表达。结果模型组、治疗组肺湿重、肺系数与空白对照组相比，肺湿重、肺系数差异均具有统计学意义（均P＜0.01）；治疗组肺湿重、肺系数与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与空白对照组相比较，模型组大鼠24 h尿量有所减少，但差异无统计学意义（P＞0.05）；葶苈子治疗组与模型组比较，大鼠24 h尿量差异有统计学意义（P＜0.01）。模型组、治疗组与空白对照组相比，PaO2、PaCO2、pH均值差异均具有统计学意义（均P＜0.01）；治疗组PaO2、PaCO2、pH与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。肉眼观，与对照组比较，模型组大鼠双肺充血水肿、肺外周可见片状炎性渗出、体积明显增大，肺泡呈粉红色，气管内有粉红色分泌物溢出，或见血性胸水；模型组100倍镜下示肺泡广泛水肿及片状炎细胞浸润，局灶性出血，结构轮廓几乎丧失，部分肺泡受压萎陷。肉眼观，治疗组较模型组大鼠双肺肿胀减轻，肺表面光滑，弹性可；光镜下治疗组肺泡可见充血水肿，炎细胞浸润，肺泡结构及轮廓显示不清，但较模型组明显减轻，肺泡内水肿液明显减少，仅见炎细胞浸润。电泳结果示，模型组APQ5蛋白表达较对照组明显下调（P＜0.01），与模型组比较，葶苈子治疗组可明显上调APQ5蛋白表达。结论葶苈子有改善急性肺损伤的效果，这种作用可能与其改善水通道蛋白5含量或者活性有关。

【关键词】急性肺损伤葶苈子提取液水通道蛋白

急性肺损伤是一种以通透性肺水肿为特征的临床综合征，治疗关键是清除肺泡水肿液。水通道蛋白（AQPs）是一种细胞膜转运蛋白，与水通透性有关，急性肺损伤发生后AQPs表达下降，机体清除水肿液能力下降，水肿液在肺泡间质聚积而加重肺泡和间质内水肿。本实验在笔者前期临床研究基础上，通过对大鼠ATⅡ进行分离和纯化，观察葶苈子水提液对急性肺损伤大鼠AQP5在ATⅡ上的表达的影响，从水通道角度研究葶苈子对急性肺损伤大鼠的作用及可能机制［1］，为临床应用葶苈子治疗急性肺损伤提供实验依据。现报告如下。

1　材料与方法

1.1动物SPF级健康雄性SD大鼠，体质量180～200 g（由华中科技大学大学实验动物中心提供）。大鼠自由饮水，常规适应性饲养1周后进行实验。饲养条件：室温20～26℃，相对湿度40%～70%。

1.2主要试剂小牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；大鼠IgG（上海博蕴生物有限公司）；内毒素（LPS）（E．coil serotype 055：B5）；AQP5抗体（美国santa cruz公司）。其他试剂为国产分析纯。葶苈子经鉴定为南葶苈子Descurainia sophia（L.）Webb ex Prantl，由中药饮片有限责任公司提供。AQP5原位杂交试剂盒和免疫组化试剂盒（均由博士德生物工程有限公司提供）。

1.3葶苈子水提液的制备取8倍量70℃水浴提取葶苈子200 g 3次，每次1 h，合并滤液浓缩至100 mL 使1 mL相当于2 g原生药。

1.4造模分组及给药健康SD大鼠18只，禁食不禁水12 h后手术。随机分为空白对照组、模型组、葶苈子干预治疗组3组。模型组和治疗组则分别经尾静脉注射LPS建立急性肺损伤模型；治疗组造模成功后给予葶苈子提取液1周，参考文献［2］剂量15 g/kg。

1.5观察指标1）干湿比重、尿量及血气分析测定：给药1周后将大鼠称质量，禁食不禁水，置于代谢笼中24 h，收集尿液并计量；24 h后留取动脉血标本，进行血气分析；处死大鼠后仰卧固定于解剖操作台上，开胸暴露气管，将左主支气管结扎，全肺称质量后计算肺系数（肺系数=全肺湿重/体质量×100%）。2）形态学研究：称重后取左侧肺组织固定于10%中性甲醛溶液中，石蜡包埋，3 μm切片，行伊红-苏木素染色。3）肺脏AQP5蛋白表达：Western-blot法测定肺脏AQP5蛋白表达，分组各取右肺中叶组织匀浆提取肺组织蛋白，凝胶电泳分离蛋白、转膜、封闭，一抗兔抗AQP5抗体（1∶1000；Cell Signaling Technology公司）；兔二抗（HRP标记羊抗兔IgG）37℃孵育1 h，化学发光，显影、定影，凝胶成像系统行目的蛋白及内参条带β-actin灰度分析，二者灰度比值为各蛋白表达强度。4）肺组织总蛋白：BCA试剂盒测定肺组织匀浆离心上清液中的总蛋白。5）肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平：ELISA法分别测定肺组织匀浆上清、BALF和血清中TNF-α（肺组织匀浆TNF-α=肺组织匀浆上清TNF-α/肺组织匀浆上清蛋白）。

1.6统计学处理应用SPSS 17.0统计软件处理。计量资料以（±s）表示。多组间均数比较均采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠肺湿重、肺系数及24 h尿量比较见表1。结果示，模型组、治疗组肺湿重、肺系数与空白对照组相比，肺湿重、肺系数差异均具有统计学意义（均P＜0.01）；治疗组肺湿重、肺系数与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与空白对照组相比较，模型组大鼠24 h尿量有所减少，但差异无统计学意义（P＞0.05）；葶苈子治疗组与模型组比较，大鼠24 h尿量差异有统计学意义（P＜0.01）。

表1　各组大鼠肺湿重、肺系数及24 h尿量比较（±s）

表1　各组大鼠肺湿重、肺系数及24 h尿量比较（±s）

与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别　n　24 h尿量（mL）治疗组　6　23.36±2.11*△△对照组　6　18.87±1.23模型组　6　12.48±0.29全肺湿重（g）　肺系数（%）3.03±0.21*△　1.00±0.09*△2.26±0.11　0.75±0.06 3.48±0.19**　0.33±0.04**

2.2各组血气分析比较见表2。模型组、治疗组与空白对照组相比，PaO2、PaCO2、pH均值差异均具有统计学意义（均P＜0.01）；治疗组PaO2、PaCO2、pH与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2　各组血气分析比较（±s）

表2　各组血气分析比较（±s）

组别n　pH治疗组　6　7.35±0.01*△对照组　6　7.39±0.05模型组　6　7.22±0.04**PaO2（mmHg）PaCO2（mmHg）86.05±2.34*△　46.07±3.15*△97.25±2.11　42.71±1.46 68.68±3.19**　66.32±3.24**

2.4各组病理形态学改变见图1。肉眼观，与对照组比较，模型组大鼠双肺充血水肿、肺外周可见片状炎性渗出、体积明显增大，肺泡呈粉红色，气管内可见粉红色分泌物，或见血性胸水；模型组100倍镜下示肺泡广泛水肿及片状炎细胞浸润，局灶性出血，结构轮廓几乎丧失，部分肺泡受压萎陷。肉眼观，治疗组较模型组大鼠双肺肿胀减轻，肺表面光滑，弹性可；光镜下治疗组肺泡可见充血水肿，炎细胞浸润，肺泡结构轮廓显示不清，但较模型组明显减轻，肺泡内水肿液明显减少，仅见炎细胞浸润。

图1　各组病理形态学改变（HE，×100）

2.5各组APQ5蛋白免疫印迹电泳表达比较见图2。电泳结果示，模型组APQ5蛋白表达较对照组明显下调，与模型组比较，葶苈子治疗组可明显上调APQ5蛋白表达。

图2　各组病理形态学改变

3　讨论

一般认为，肺水肿主要由于肺泡上皮/微血管内皮屏障功能失调及肺泡间隙受损所致，而对AQPs调节水的转运、维持肺液平衡的作用认识不足。

现已证实有4种（AQPI、3、4、5）水通道蛋白与急性肺损伤有密切关系，水通道蛋白，AQP5主要分布于肺毛细血管内皮细胞、肺泡I型上皮细胞和气道上皮细胞上，研究证实AQP5敲除小鼠肺泡和毛细血管间的渗透性、水通透性均降低90%以上［4］，表明AQP5可能参与了急性肺损伤的发生。LPS致肺损伤动物模型研究发现，AQP1和AQP5表达下调［5］。王珏实验研究表明，在模型组大鼠胸水中AQP1含量高于各治疗组［6］。AQPs表达量或功能失调降低了肺损伤时其对肺组织中过多液体的清除能力，加重了肺泡和间质水肿，从而进一步影响AQPs表达，导致病情恶化。笔者实验结果发现，在急性肺损伤大鼠肺脏中AQP5表达明显低于正常大鼠，进一步证实了以上结论。

“葶苈子为肺家气分药，大泻肺之力尤强”（《药性论》）。北宋《开宝本草》述该药为“疗肺壅上气咳嗽，止喘促，除胸中痰饮”。李时珍曰“肺中水气贲郁满急者，非此不能”。可见葶苈子以通利水道善治一身上下内外之水气留滞之病为特长。药理研究证实［7-8］，葶苈子以其利尿作用，从而达到降低静水压的效果，根据Starlnig定律不难推测，葶苈子可以增加肺泡至肺毛细血管的液体的通透性。前期笔者采用葶苈子为君药的葶苈大枣泻肺汤在ICU中治疗胸腔积液、肺水肿、脑水肿等危重病患者，均取得了良好的疗效［9-11］；在笔者的研究也发现葶苈子不仅可以显著减轻肺水肿及肺瘀血，而且改善了肺损伤大鼠的动脉血气。

中医学认为伤津、耗液，不仅是水分的消耗，也可使正气受损导致组织细胞功能受损，甚至形态结构改变。肺之“输布津液”与“宣发肃降”功能与气管黏液分泌、肺泡腔和血管腔间水的转运及选择性转运水液的AQPs与津液代谢相关，表明AQPs可能是中医学津液病证产生的分子学基础之一［11-13］。本研究结果示，葶苈子治疗组肺水肿效果明显，AQP5蛋白表达增加，表明AQP5可能参与了肺水肿的发病，而葶苈子改善肺损伤可能通过上调AQP5表达发挥作用。

综上所述，针对LPS诱导的急性肺损伤，葶苈子提取液有效地改善了急性肺损伤引起肺淤血、肺水肿及动脉血气改变；这种效果可能与其改善水通道蛋白5含量或者活性有关。

参考文献

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［10］夏昔.葶苈大枣泻肺汤在治万中毒性肺水肿中的应用［J］.上海中医药杂志，1993，39（8）：23-25.

［11］胡利群，丁建中.水通道蛋白与肺部疾病研究进展［J］.长江大学学报：自然科学版，2008，5（4）：83-86.

［12］杨光，林明侠，万羽.葶苈子的药理作用及临床应用概况［J］.中医药信息，2001，18（2）：12-13.

［13］马梅芳，吕文海.葶苈子近30年研究进展［J］.中医药信息，2005，22（5）：35-36.

·研究报告·

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Effects of Semen Lepidii on the Expression of Aquaporin-5 of Alveolar Cells TypeⅡin Rats with Endotoxin Induced Acute Lung Injury

ZHANG Zhaohui，XU Xiaoyun，QU Xingguang，et al.Department of ICU，the First College of Clinical Medical Science，Three Gorges University & Yichang Central People′s Hospital，Hubei，Yichang 443003，China.

【Abstract】Objective：To observe the effect of semen lepidii on the expression of aquaporin-5 of alveolar cells typeⅡin rats with endotoxin induced acute lung injury.Methods：18 Clean SD rats were randomly divided into the control group，the model group and lepidii group.The model of acute lung injury was established with tail vein injection of endotoxin，and the rats were executed 4 hours after successful modeling.24 hours urine output was measured.The blood was collected and blood gas analysis was detected.Both lungs were removed and weighed.The lung coefficient was calculated.HE staining was used to observe the pathological changes of lung tissue and the expression of AQP5 was detected with the method of immuno electrophoresis.Results：Compared with the control group，there was statistical significance in the level of lung wet weight and lung coefficient of the model group and lepidii group（P＜0.01），as well as in the comparison of lepidii group and the model group（P＜0.05）.Compared with the control group，24 hours urine output of the model group decreased a little，without statistical significance（P＞0.05）.However，it was opposite in the comparison between the lepidii group and the model group （P＜0.01）.The mean difference in PaO2，PaCO2and PH among the three groups had statistical significance（P＜0.01），as well as in the comparison of lepidii group and the model group（P＜0.05）.Gross appearance showed that compared with the control group，there was congestion and edema in both lungs and patchy inflammatory exuda-tion in peripheral lung in the model group；volume increased significantly with pink alveolar，pink secretion from airway and maybe bloody pleural fluid.100 times under the light microscope，there was alveolar edema，patchy inflammatory exudation and focal hemorrhages；structure outlines were almost lost；part of alveolar collapsed because of pressure.Gross appearance showed that compared with the model group，edema in both lungs relieved with smooth surface and resilience.Under the light microscope，there was congestion and edema in alveolar，inflammatory exudation，vague outlines in lepidii group.However，compared with the model group，the alveolar edema was significantly decreased，only seeing inflammatory exudation.Electrophoresis results showed that the drop of APQ5 expression in the model group was more obvious than that of the control group（P＜0.01），and compared with the model group，the increase of APQ5 expression in lepidii group was more obvious.Conclusion：Lepidii can improve acute lung injury，which may be related with its improvement on the content or activity of aquaporin-5.

【Key words】Acute lung injury；Semen lepidii；Aquaporin

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1004-745X（2016）04-0606-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.04.012

*基金项目：湖北省宜昌市科技攻关项目

通信作者△（电子邮箱：1410956890@qq.com）

收稿日期（2015-11-02）