贵州不同仓贮环境对醇化片烟蛋白质及氨基酸含量的影响

陈 颐，杨佳玫，王玉平，卢志伟，苏 宇，杨虹琦*

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128；2.贵州中烟工业有限责任公司，贵阳 550009）

贵州不同仓贮环境对醇化片烟蛋白质及氨基酸含量的影响

陈 颐1，杨佳玫2，王玉平2，卢志伟2，苏 宇1，杨虹琦1*

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128；2.贵州中烟工业有限责任公司，贵阳 550009）

为探究不同仓贮环境及不同产地片烟蛋白质及氨基酸含量的变化规律，以位于贵州兴义、贵阳和贵定的3个醇化库中6个产地片烟为材料，对醇化片烟的蛋白质、游离氨基酸和游离脯氨酸含量进行了动态变化分析。结果表明：（1）片烟醇化过程中，3个醇化库不同产地片烟的蛋白质含量持续下降，游离氨基酸含量在醇化12个月内上升，但醇化12个月后下降；（2）醇化过程中片烟游离脯氨酸含量持续升高，与游离氨基酸总量呈现不同的变化趋势，所以醇化片烟中脯氨酸氧化分解较少。（3）醇化6～18个月时，清香型和中间香型片烟蛋白质含量的变化幅度存在显著差异，但浓香型片烟的蛋白质含量变化幅度均差异不显著；醇化12～18个月时，浓香型片烟游离氨基酸含量的变化幅度存在极显著差异。（4）受环境温湿度的影响，兴义库片烟蛋白质和游离氨基酸含量的变化幅度均大于贵阳库和贵定库片烟，并且同一醇化库中不同产地片烟蛋白质和游离氨基酸的降解幅度均存在差异。因此，仓贮环境对片烟醇化过程中蛋白质和氨基酸含量有较大影响，进而将影响片烟醇化质量及效益。

片烟；醇化；仓贮环境；蛋白质；游离氨基酸

醇化也叫陈化，是指烟叶烘烤和复烤后，在自然条件下烟叶某些品质缺陷（如青杂气、刺激性和异味）缓慢减少，香气更加显露，吸食品质明显提高的过程[1-3]。仓贮环境是片烟醇化过程中化学成分变化的主要影响因子之一。目前研究普遍认为，影响烟叶醇化质量和仓储损耗程度的因素主要有温度、相对湿度、烟叶含水率和空气含氧量[4-5]。因此，围绕影响片烟仓贮主要环境因素及其对烟叶化学成分影响的研究，已成为国内外烟草研究工作者关注的热点[6-7]。宋纪真等[8]对不同仓贮环境片烟感官质量变化的研究结果表明，不同仓贮环境对片烟的感官质量影响较大，其中低温高湿的仓贮环境不利于片烟的自然醇化，而高温适湿仓贮环境的片烟感官质量较优。程昌新等[9]对不同储藏醇化措施的烟叶品质进行了研究，结果表明，黑膜覆盖+喷施酶制剂的处理，烟叶总糖、总氮、蛋白质含量略有降低，还原糖含量略微升高，烟叶化学成分趋于协调，在烟叶感官品质方面也最优。

烤烟中对烟叶品质及烟气质量影响较大的含氮化合物主要有蛋白质、游离氨基酸以及烟碱等。其中的蛋白质可分为难溶性蛋白质和可溶性蛋白质两类，可溶性蛋白主要是残留于烟叶中的酶蛋白，难溶性蛋白则是存在于细胞壁中，与纤维素和基质多糖形成共价连接的胞壁蛋白质分子。烤烟成熟调制过程中，大部分可溶性蛋白质被蛋白酶降解成氨基酸和寡肽，而胞壁蛋白受质膜和基质多糖的阻隔难以被蛋白酶降解[10]。但在烟叶醇化过程中，片烟中的胞壁蛋白在微生物分泌的蛋白酶作用下将降解为氨基酸[11]。烟叶中的氨基酸可分为常见蛋白氨基酸、稀有蛋白质氨基酸和非蛋白氨基酸三大类，这些游离氨基酸在高温烘烤或游离基反应条件下发生酶促和非酶促棕色化反应，产生具有焦香和焦甜香成分[12-14]。协调片烟中蛋白质和游离氨基酸含量，是卷烟工业通过自然醇化促使烟叶的化学成分协调，提高烟叶感官品质，达到适宜工业可用性目标的有效途径。本文系统研究不同仓贮环境下片烟蛋白质和氨基酸含量的动态变化规律，旨在为合理贮存烤烟原料、改善片烟质量提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2013年6月至2015年6月在贵州中烟贵州兴义、贵州贵阳和贵州贵定标准贮烟仓库进行。片烟均按文献[15-16]进行养护管理，片烟装箱水分统一控制在13%±0.5%，装箱温度控制在（40±3）℃，装箱密度为200 kg/箱，烟箱距地面高度200 mm，每4～5个烟箱成堆成一垛，距墙壁距离300 mm。本试验选取经打叶复烤后的湖南郴州、河南许昌浓香型中部片烟，贵州遵义中间香型中部片烟，四川凉山、云南保山和福建三明清香型中部片烟各3箱作为试验分析材料。

1.2 试验设计

从2013年6月开始，每隔6个月取样1次，至贮存期达到18个月后，每隔3个月取样1次，共计取样6次，醇化周期为24个月。取样方法为开箱取样，弃表层片烟后，按照对角线取样法从每个箱烟中取500 g片烟混合均匀，再从中取约2 kg片烟并分成两份，一份切丝用于感官评吸，另一份粉碎并过60目筛，装入样品袋密封并保存于4 ℃冰柜中，用于化学成分检测。

在片烟自然醇化过程中，采用干湿球温度计定期监测片烟醇化库环境温湿度变化，同时记载醇化箱内片烟有无霉变和虫害情况。

1.3 测定方法

片烟游离氨基酸和蛋白质的提取[17]：准确称取烟样（干燥、磨细、过60目筛）0.5 g于200 mL的锥形瓶中，加入10 mL 10%冰醋酸，封口超声10 min后，过滤，滤液用于游离氨基酸含量检测，滤渣及滤纸放入消化瓶中，于平板电炉上消化，并采用凯氏定氮法测定总氮含量[18]。

片烟游离脯氨酸含量采用磺基水杨酸法提取和测定[17]：准确称取烟样（干燥、磨细、过60目筛）0.5 g于研钵中，加2～3 mL 3%磺基水杨酸研磨提取，定容5 mL，转入沸水浴提取10 min。冷却后以3000 r/min离心10 min，上清液用茚三酮比色法测定游离脯氨酸含量。

片烟游离氨基酸总量采用10%醋酸提取，茚三酮显色法测定[17]；片烟蛋白质含量采用总氮含量乘以系数6.25的方法换算。

1.4 数据统计

所有数据均采用EXCEL、SPSS17.0等分析软件进行方差分析、计算和统计作图表。

2 结 果

2.1 3个醇化库全年月平均温湿度的变化

由图1可知，3个醇化库全年月平均温度变化呈现“降-升-降-升”的形态，这是因为本试验醇化0、12和24个月的取样时间均在仓贮环境温湿度相对较高的6月份，此阶段3个仓库的月平均温度在19.74～28.13 ℃，月平均相对湿度在55.67%～78.78%。而醇化6个月、醇化18个月和醇化21个月的取样时间均在仓贮环境温湿度相对较低的12月或3月份，此阶段3个仓库的平均温度在9.5～17.90 ℃，平均相对湿度在54.38%～73.47%。其中，兴义库的全年月平均温度明显高于贵阳库和贵定库，而贵阳库和贵定库的全年月平均温度相差不大。3个仓库的平均相对湿度差异较大，3月和6月份贵阳库的月平均相对湿度最高，其次为兴义库，贵定库的月平均相对湿度最低；12月份贵阳库的月平均相对湿度下降至与兴义库相同。

图1 3个片烟醇化库月平均温度和相对湿度的动态变化Fig. 1 The dynamic changes of monthly average temperature and relative humidity in three tobacco aging storehouses

2.2 3个醇化库片烟蛋白质含量的动态变化

由图2可见，在片烟醇化过程中，3个醇化库不同产地片烟蛋白质平均含量从11%持续下降至6%以下。由表1可知，醇化6～12个月和12～18个月时，3个醇化库中清香型和中间香型片烟蛋白质含量的变化幅度存在显著差异，但浓香型片烟蛋白质含量的变化幅度差异不显著。其中兴义库中云南保山、四川凉山、福建三明和贵州遵义片烟的蛋白质含量下降幅度最大，这说明兴义库月平均气温较高可加速蛋白质的分解速度。

2.3 3个醇化库片烟游离氨基酸含量的动态变化

3个醇化库不同产地片烟游离氨基酸含量的动态变化见图3和表2。由图3看出，在片烟醇化过程中，3个醇化库不同产地片烟游离氨基酸的含量呈现先增加后持续下降的变化，并且除河南许昌烟叶的游离氨基酸含量是由2.5%左右下降至1.5%之外，其他产地片烟的游离氨基酸含量均由1.8%左右下降至1%以下。由表2可知，醇化6～12个月时，3个醇化库不同产地片烟的游离氨基酸含量的变化幅度均存在显著差异，并且均为兴义库片烟氨基酸含量的变化幅度最大。但醇化12～18个月后片烟游离氨基酸含量开始下降时，仅河南许昌和湖南郴州浓香型片烟游离氨基酸含量的变化幅度存在极显著差异，其余产地片烟的氨基酸含量变化幅度的差异均不显著。由于片烟在醇化0～12个月游离氨基酸含量的升高与同一时期片烟蛋白质含量下降存在对应关系，所以醇化过程中片烟氨基酸含量的升高，是蛋白质分解产生氨基酸导致的结果，而醇化12个月后片烟游离氨基酸含量下降说明片烟氨基酸在醇化过程中会继续分解。

图2 3个醇化库片烟的蛋白质含量动态变化Fig. 2 The dynamic changes of the protein content in three tobacco aging storehouses

表1 3个醇化库片烟蛋白质含量的变化幅度Table 1 The protein content variations range of tobacco strips in three aging storehouses %

图3 3个醇化库片烟游离氨基酸含量的动态变化Fig. 3 The dynamic changes of the free amino acid content in three tobacco aging storehouses

表2 3个醇化库片烟游离氨基酸含量的变化幅度Table 2 The free amino acid content variations range of tobacco strips in three aging warehouses %

2.4 3个醇化库片烟游离脯氨酸含量的动态变化

由图4可知，在片烟醇化过程中，3个醇化库不同产地片烟的脯氨酸含量由0.3%左右持续上升至0.5%以上。由表3可知，醇化6～12个月时，3个醇化库不同产地片烟游离脯氨酸含量的变化幅度都存在显著差异，并且均以兴义库片烟脯氨酸含量上升幅度最大，其余醇化时段不同产地片烟脯氨酸含量的变化幅度差异不显著。醇化过程中片烟脯氨酸的含量与游离氨基酸含量呈现不同的变化规律，说明细胞壁蛋白降解产生的脯氨酸不能继续氧化分解。

3 讨 论

片烟中的含氮化合物主要包括烘烤后残留的蛋白质、氨基酸和其他一些含氮杂环化合物。在自然醇化过程中，片烟含氮化合物一般经微生物作用和氧化作用被降解或挥发[19]。巩效伟等[20]认为，片烟中的蛋白质是复杂的高分子化合物，性质比较稳 定，在醇化过程中，一般变化不大，而游离氨基酸是可溶性含氮化合物，在醇化过程中呈现下降的趋势。但该文并未对醇化过程中蛋白质的含量进行追踪监测。本试验结果表明，片烟中的蛋白质含量在醇化过程中持续下降，游离氨基酸含量伴随蛋白质的降解先升高后下降，而脯氨酸含量则呈现持续升高的变化规律。众多研究表明[10]，在烟叶烘烤变黄期，鲜烟叶中的细胞质蛋白和膜蛋白已由蛋白酶催化分解为游离氨基酸，但受质膜和胞壁多糖的阻隔，存在于细胞壁中富含脯氨酸和羟脯氨酸的结构蛋白很难被胞内蛋白酶所降解，因而烤后烟叶始终含有10%左右的蛋白质。这些残余蛋白质不去除，烟丝在燃烧时会产生臭味和刺激性，极大影响烤烟的感官评吸质量，这也是烟叶需要经过长时间自然醇化的主要原因。赵铭钦等[21]研究表明，烤后烟叶中仍存在微生物和酶活性，它们是烟叶醇化过程中促进蛋白分解的主要因素[22]。本试验结果表明，烟叶醇化过程中蛋白质的降解还受到仓贮环境温湿度的影响，环境温湿度越高，微生物繁殖越快，蛋白质降解的幅度越大。片烟醇化过程中游离氨基酸和脯氨酸含量的升高与片烟蛋白质的降解密切相关，并且蛋白质含量下降伴随着游离氨基酸和脯氨酸含量升高。这种蛋白质与氨基酸含量同步的变化足以说明片烟醇化过程中蛋白质发生了降解，并产生了许多游离氨基酸。前人对微生物氮代谢的研究结果表明[23]，微生物对氨基酸的转化利用的方式有两种：一种是通过脱氨基作用，将氨基酸分解转变为氨气和α-酮酸。其中的氨气可以释放到空气中，而α-酮酸则留存于烟叶中，这可能是烟叶pH下降的原因之一。第二种方式是通过脱羧基作用，将氨基酸分解为CO2和胺，其中CO2可以释放到空气中，而胺则有可能与还原糖发生非酶棕色化反应生成美拉德产物。有研究表明[24]，甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸均可参与非酶棕色化反应，特别是含有羟基的氨基酸，在自由基的作用下易发生游离基反应形成美拉德反应的中间化合物席夫碱[25]，可见游离氨基酸的氧化分解与烤烟pH下降及烟叶致香物质形成存在一定相关性。

图4 3个醇化库片烟游离脯氨酸含量的动态变化Fig. 4 The dynamic changes of the free proline content in three tobacco aging storehouses

表3 不同醇化库片烟游离脯氨酸含量的变化幅度Table 3 The free proline content variations range of tobacco strips in three aging storehouses %

植物细胞壁结构蛋白的特征之一是其氨基酸组成中富含脯氨酸和羟基脯氨酸，脯氨酸也是植物体内重要的渗透调节物质，它可以在干旱等逆境条件下起保护和稳定蛋白质结构的作用[26]。然而，值得关注的是游离氨基酸含量的变化与游离脯氨酸的变化趋势完全不同，前者在醇化12～18个月升高后又下降，而后者则呈现持续升高的变化趋势。醇化过程中游离脯氨酸含量持续升高的现象表明，微生物对游离脯氨酸的氧化分解和再利用能力很低，而对其他氨基酸的氧化分解和再利用能力较高。这可能与脯氨酸的侧链基团与α-氨基形成了共价键，使之成为α-亚氨基酸，因而难于发生脱氨基反应有关[27]。有关醇化过程中哪些游离氨基酸组分易于被 微生物分解还需做进一步的研究。

4 结 论

本研究结果表明，醇化过程中，不同产地片烟的蛋白质含量均表现出持续下降的变化趋势，而游离氨基酸含量同步升高；醇化12个月后，游离氨基酸含量开始迅速下降，表明醇化过程中蛋白质和氨基酸在不断分解。蛋白质与氨基酸的下降幅度与仓贮环境温度有关。兴义仓库环境温度高于贵阳库和贵定库，因而其微生物和蛋白酶活性较高，片烟蛋白质和游离氨基酸的降解幅度也高于贵阳库和贵定库片烟。片烟醇化过程中，游离脯氨酸含量持续升高，并且与片烟游离氨基酸含量呈现不同的变化趋势，表明醇化过程中胞壁蛋白质被分解，从而使片烟中脯氨酸的含量升高，并且脯氨酸不能进一步被氧化分解。

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Influence on Protein and Amino Acid Contents of Tobacco Strips by Different Storing Conditions in Guizhou

CHEN Yi1, YANG Jiamei2, WANG Yuping2, LU Zhiwei2, SU Yu1, YANG Hongqi1*

(1. Hunan Agricultural University, College of Biological Science and Technology, Changsha 410128, China; 2. China Tobacco Guizhou Industrial Co., Ltd., Guiyang 550009, China)

The dynamic changes of proteins, free amino acids and proline in tobacco strips from six producing areas located in three aging storehouses of Xingyi, Guiyang and Guiding, which belong to China Tobacco Guizhou Industrial Co., Ltd, were analyzed to study the patterns of changes of protein and free amino acid contents of tobacco strips under different storing conditions and from different producing areas. The results showed that: (1) During the aging process, the protein content of tobacco strips in different producing areas of three aging storehouses declined consistently. The content of free amino acids increased in the first 12 months of aging , then went down after 12 months of aging. (2) The free proline content increased consistently, and the changing pattern was different from that of free amino acids, suggesting that little of the free proline in tobacco strips was oxidized during the aging process. (3) During the 6th to 18th month of aging, there was significant change in the protein content of tobacco strips for strong flavor and middle flavor type, but not the tobacco strips of strong flavor type. During the aging process from 12 to 18 months, highly significant change in free amino acid content was observed in strong flavor type of tobacco strips. (4) Being affected by environmental temperature and humidity, the change in protein and free amino acid contents of tobacco strips in Xingyi storehouse was larger than that in Guiyang and Guiding, For tobacco strips stored in the same aging storehouse, significant difference of the extent to which protein and free amino acid decreased was observed between different tobacco producing areas. Thus, storing conditions had great compacts on protein and amino acid contents in tobacco strips during aging, and then affected the aging quality and profits of tobacco strips.

tobacco strips; aging; storing condition; protein; free amino acid

TS41+1

1007-5119（2016）06-0082-08

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.06.015

贵州中烟工业有限责任公司项目“烟叶醇化过程质量研究”（12121）

陈 颐（1987-），男，在读博士研究生，主要从事烟草仓贮技术研究。E-mail：229781579@qq.com。*通信作者，E-mail：csyhq@sina.com

2016-07-14

2016-11-20