三种土壤湿度状况下烟草孢囊线虫侵染特征比较

许冠堂，赵洪海

（青岛农业大学农学与植物保护学院，山东省植物病虫害防控重点实验室，青岛 266109）

三种土壤湿度状况下烟草孢囊线虫侵染特征比较

许冠堂，赵洪海*

（青岛农业大学农学与植物保护学院，山东省植物病虫害防控重点实验室，青岛 266109）

为明确土壤湿度对烟草孢囊线虫（Heterodera glycines，HGT）侵染的影响，采用定量接种和杯栽试验方法，通过定期取样、土壤中线虫分离和根组织中线虫染色后镜检，测定了3种土壤湿度—低湿度（体积含水量MVP 3%～9%）、中湿度（MVP 15%～25%）和高湿度（MVP 30%～40%）状况下HGT不同虫态群体密度及其动态变化。结果表明，与中湿度处理相比，低湿度处理下，HGT 2龄幼虫在土壤中的孵化和对根系的侵入均受到抑制，根组织中3龄和4龄幼虫发育量明显减少且发育进程延迟；高湿度处理下，HGT 2龄幼虫对烟草根系的侵入加快，根组织中3龄和4龄幼虫的发育提前。低、中和高湿度处理下HGT的繁殖系数（Rf）分别为0.7、1.0和0.4。可见，土壤湿度过低和过高均不利于HGT正常侵染，湿度过高对HGT繁殖的抑制作用尤其明显。

烟草孢囊线虫；湿度处理；发育进程；繁殖系数

植物寄生线虫是多种作物上的有害生物，对世界农业造成相当大经济损失[1]。烟草孢囊线虫病是烟草重要病害，在国外由烟草球孢囊线虫3个亚种（Globodera tabacum subsp. tobacum、G. tobacum subsp. virginiae和G. tobacum subsp. solanacearum）引起，在我国由大豆孢囊线虫（Heterodera glycines）引起，其严重侵染可导致烟叶产量和品质的明显降低[2-4]。目前烟草孢囊线虫病只发生在我国的山东和河南两省，在山东省发生普遍[5]。烟草孢囊线虫病对烟草的损害程度除取决于烟草品种抗性和线虫群体密度外，还受温湿度等环境因素的影响[2,6-7]。线虫在土壤中的活动离不开水，其存活、孵化和侵入均受土壤水分的影响[8]。本项目组研究表明，在烟草生长期阶段性长期（1～2个月）过度浇水明显抑制烟草孢囊线虫（H. glycines）的侵染[9]，但土壤水分不足对烟草孢囊线虫的侵染有何影响尚未测定。故而设计本试验，拟在探讨低、中、高3种土壤湿度下烟草孢囊线虫的侵染特征，为其综合治理水分管理这一农业防控措施的实施提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

用于接种的线虫群体为侵染烟草的大豆孢囊线虫（Heterodera glycines），在此缩写为HGT，采自山东省诸城市辛兴镇烟叶农场。烟草品种为中烟100，由中国农科院烟草研究所提供。烟草定植器采用容积为210 mL的聚丙烯水杯，杯高8.5 cm。

1.2 线虫接种

2015年5月7日，60个水杯装砂壤土，装土量150 g/杯，然后每杯移栽1株3～4片真叶烟苗，充分浇水后置温室内在22～32 ℃下缓苗。5 d后当水杯土壤体积含水量降至5%时接种HGT：在烟株周围土壤上用玻璃棒打3个孔，孔深至烟草根系水平，孔内分别置入3、3和4个大小一致的饱满孢囊（接种前先将孢囊刺破，以便于日后调查时新生孢囊的甄别），压土封孔。每杯共接种孢囊10个，即HGT初始孢囊群体密度（Pi）为6.7个/100g土壤。

1.3 土壤湿度处理和烟株培养

2015年5月12日接种孢囊后，立即对杯土进行3种土壤湿度处理，处理数量为每处理20 杯。低湿度处理：不浇水，保持5%的体积含水量；中湿度处理：浇水15 mL/杯，使土壤体积含水量达20%；高湿度处理：浇水25 mL/杯，使土壤体积含水量达35%。处理后将杯苗立即放置在光照培养箱中，在12 h光照/12 h黑暗、25 ℃和80% RH下培养35 d。在培养过程中，使用土壤湿度测量仪每隔48 h检测1次杯土湿度并及时补充水分，将低、中和高湿度处理的杯土体积含水量分别控制在3%～9%、15%～25%和30%～40%范围内。

1.4 调查和检测方法

取样：接种线虫后第10、20、30和35天各取1次样，每个处理每次取5杯。将烟草根系上的白色雌虫（如果有）全部抖落到各自杯土中，然后分离各杯土壤中的线虫，并对各杯根组织中的线虫染色。

土样中线虫的分离和计数：采用淘洗-过筛法和淘洗-过筛-贝曼漏斗法分离每个水杯土壤中的白色雌虫、孢囊和2龄幼虫（J2）[10]，在解剖镜下对白色雌虫、新生孢囊和J2进行检查并计数。

根组织中线虫的染色和计数：采用次氯酸钠-酸性品红染色法对每个水杯烟草根组织内的线虫进行定量染色[10]，在解剖镜和显微镜下对J2、3龄幼虫（J3）和4龄幼虫（J4）进行检查并计数。

1.5 数据统计与分析

计算每100 g土壤中J2和孢囊（新生孢囊+白色雌虫）的数量以及1 g根组织中J2、J3和J4的数量，即不同虫态的群体密度。利用Excel 2003软件对各调查时期的线虫群体密度，即线虫群体动态，进行制图；利用DPS数据处理系统软件（DPS 14.50）中的Duncan新复极差法对试验数据进行统计分析。HGT在3种土壤湿度下侵染水平的评价采用繁殖系数（reproduction factor，Rf）法：Rf=孢囊最终群体密度（Pf）/孢囊初始群体密度（Pi），本试验中Pi为6.7个/100 g土壤。

2 结 果

2.1 HGT 幼虫群体动态

由图1看出，接种线虫后第10天，低湿度处理的土壤中未检测到J2，而中、高湿度处理的土壤中存在J2。接种线虫后第20天，低湿度处理的土壤中出现大量J2，而高湿度处理的土壤中J2群体密度最小。接种线虫后第30天，低和中湿度处理的土壤中J2群体密度均达其高峰值，而高湿度处理的土壤中也存在较大数量J2（图1）。

由图2看出，接种线虫后第10天，低湿度处理的烟草根组织中未检测到J2，而中和高湿度处理的已出现J2，高湿度处理的J2群体密度最大。接种线虫后第20天，低湿度处理的根组织中才开始出现J2，且J2群体密度最大。接种线虫后第35天，低和中湿度处理的根组织中J2群体密度达其高峰值。接种线虫后第10天和第20天（HGT世代进程的前中期，下同），低、中和高湿度处理的烟草根组织中J2平均群体密度分别为5.3、7.4和8.9个/g根，侵入量依次增加。

由图3看出，接种线虫后第10天，低湿度处理的烟草根组织中未检测到J3，而中和高湿度处理的已出现J3，高湿度处理的J3群体密度最大。接种线虫后第20天，低湿度处理的根组织中才开始出现少量J3。低、中和高湿度处理的根组织中J3发育高峰分接出现在接种后第35天、第20天和第20天。接种线虫后第10天和第20天，低、中和高湿度处理的烟草根组织中J3平均群体密度分别为4.3、37.2和54.7个/g根，J3发育量依次增加。

由图4看出，接种线虫后第10天，3种湿度处理的烟草根组织中均未检测到J4。接种线虫后第20天，3种湿度处理的根组织中均出现J4。低、中和高湿度处理的根组织中J4发育高峰分接出现在接种后第35天、第30天和第20天。接种线虫后第10天和第20天，低、中和高湿度处理的烟草根组织中J4平均群体密度分别为0.6、1.2和2.6个/g根，J4发育量依次增加。

图1 烟草孢囊线虫2龄幼虫(J2)在土壤中的群体动态Fig. 1 Population dynamics of the 2nd stage juveniles of tobacco-infecting cyst nematode in soil

图2 烟草孢囊线虫2龄幼虫(J2)在根组织中的群体动态Fig. 2 Population dynamics of the 2nd stage juveniles of tobacco-infecting cyst nematode in roots

图3 烟草孢囊线虫3龄幼虫(J3)在根组织中的群体动态Fig. 3 Population dynamics of the 3rd stage juveniles of tobacco-infecting cyst nematode in roots

图4 烟草孢囊线虫4龄幼虫(J4)在根组织中的群体动态Fig. 4 Population dynamics of the 4th stage juveniles of tobacco-infecting cyst nematode in roots

从以上结果可以看出，与中湿度处理相比，低湿度处理下，HGT J2在土壤中的孵化和对根系的侵入均受到抑制，根组织中J3和J4发育量明显减少且发育进程延迟；高湿度处理下，HGT J2对烟草根系的侵入加快，根组织中J3和J4的发育提前。

2.2 HGT新生孢囊群体动态

由图5看出，接种线虫后第10天，3种湿度处理的烟草土壤中均未检测到新生孢囊（含白色雌虫，下同）。接种线虫后第20天，3种湿度处理的新生孢囊均已出现，高湿度处理的新生孢囊群体密度最大。之后，3种湿度处理的新生孢囊群体密度均呈上升趋势，均于接种后第35天达发生高峰，低、中和高湿度处理的高峰值分别为4.7个、6.8个和2.4个/100 g土壤，即各自湿度处理的HGT孢囊最终群体密度（Rf）。本试验中孢囊初始群体密度（Pi）均为6.7，由此推算，低、中和高湿度处理下HGT的繁殖系数分别为0.7、1.0和0.4。

试验同时发现，3种湿度处理的白色雌虫最大群体密度出现在接种后第30天。

图5 烟草孢囊线虫新生孢囊在土壤中的群体动态Fig. 5 Population dynamics of the newly-formed cysts of tobacco-infecting cyst nematode in soil

3 讨 论

在20.0和22.2 ℃条件下，大豆孢囊线虫（Heterodera glycines）在大豆上完成1个世代需要22～37 d[11]；侵染烟草的大豆孢囊线虫（HGT）在田间烟草上可以完成4个世代，平均世代历期27 d[12]。本研究中，在土壤中湿度（体积含水量15%～25%）下，HGT于接种后第20天出现J3发育盛期，于接种后第30天出现J4发育和白色雌虫形成盛期，并于接种后第30天和第35天分别出现J2土壤孵出和根系侵入高峰，表明于接种后30 d HGT已基本完成了1个世代，符合其世代发生规律。在土壤高湿度（体积含水量30%～40%）下，HGT虽然在前中期有较快的侵入和根内发育，且J3和J4发育量最大，但最终形成的孢囊（或雌虫）却最少，繁殖系数（Rf）不到中湿度下Rf的50%，究其原因，可能由于较长期的高湿胁迫[7,13-14]和/或土壤较长期高湿条件致使烟碱在根系中大量积累而对根内线虫产生毒害作用[9,15]，导致根内大部分J4无法成功发育为雌虫。土壤水分过饱和条件下，可造成O2含量过低、CO2大量积累和（或）毒素增加，对线虫和植物产生伤害[16]，势必影响线虫的繁殖。例如Singh等[17]研究发现，木豆孢囊线虫（Heterodera cajani）在重量含水量24%下繁殖良好，Rf高达19.4，而在重量含水量40%下繁殖明显受到抑制，Rf仅为0.4。

线虫在土壤中的活动离不开水，土壤干燥势必影响其存活、孵化、移动和侵染。砂质粘壤土当重量含水量为7.2%～13.0%时，肾状肾形线虫（Rotylenchulus reniformis）能够很好侵染大豆，当其为3.4%～5.8%时侵入量明显下降[18]；当土壤体积含水量为9.6%时，小麦孢囊线虫（Heterodera avenae）病情指数为88.7，当其为4.7%时病情指数低于60.0[19]；我国胶东地区3—4月持续严重干旱，导致非灌溉麦田小麦孢囊线虫群体明显下降[20]；大豆生长季前期土壤持续干旱，导致大豆孢囊线虫第1代发生量小而不明显，且与第2代世代重叠严重[21]。从以上研究结果看出，土壤缺水对线虫侵染和繁殖不利；而本研究则进一步表明，土壤低湿度（体积含水量3%～9%）下，HGT的孵化和侵入受到抑制，根内线虫发育延迟，Rf有所下降。此外，从本研究结果可以推测，较长时间土壤高湿比一般性土壤干旱对HGT的抑制效果更加明显，而土壤湿度适中或土壤时而干旱时而潮湿有利于HGT的发生和危害。

参考文献

[1] Nicol J M, Turner S J, Coyne D L, et al. Current nematode threats to world agriculture[C]//Jones J, Gheysen G, Fenol C. Genomics and molecular genetics of plant-nematode interactions. Dordrecht: Springer, 2011: 21-43.

[2] Johnson C S, Way J, Barker K R. Nematode parasites of tobacco[C]//Luc M, Sikora R A, Bridge J. Plant parasitic nematodes in subtropical and tropical agriculture (2nd Edition). Wallingford: CABI Publishing, 2005: 675-708.

[3] 程子超，赵洪海，李建立，等. 山东省寄生烟草的孢囊线虫种类鉴定及种内群体间rDNA-ITS-RFLP分析[J]. 植物病理学报，2012，42（4）：387-395.

[4] 王凤龙，王刚. 图说烟草病虫害防治关键技术[M]. 北京：中国农业出版社，2013：47-48.

[5] 程子超，赵洪海，王凤龙. 胞囊线虫在我国烟区的分布及发生世代调查[C]//王凤龙，王刚. 烟草有害生物调查研究与防治实践. 北京：中国农业出版社，2012：24-29

[6] Wang J, Johnson C S, Eisenback J D. Effects of host resistance and temperature on development of Globodera tabacum solanacerum[J]. Journal of Nematology, 2001, 33(2-3): 132-136.

[7] 赵洪海，丁海燕，王凤龙. 大豆和烟草上大豆孢囊线虫田间侵染特征比较分析[J]. 中国农业科学，2014，47（22）：4417-4425.

[8] 刘维志. 植物病原线虫学[M]. 北京：中国农业出版社，2000：89-93.

[9] 董秋月，郑玉华，赵洪海. 土壤水分对烟草孢囊线虫侵染和烟碱含量的影响[J]. 中国烟草科学，2015，36（5）：64-68.

[10] 段玉玺. 植物线虫学[M]. 北京：科学出版社，2011：199-213.

[11] 王振华，时立波，吴海燕，等. 大豆根内胞囊线虫发育进程及分布[J]. 中国农业科学，2009，42（9）：3147-3153.

[12] 赵洪海，程子超，王凤龙. 山东省烟草孢囊线虫的群体动态和世代发生特点[J]. 植物保护学报，2103，40（6）：529-532.

[13] Heatherly L G, Young L D, Epps J M, et al. Effect of upper-profile water potential on numbers of cysts of Heterodera glycines on soybean[J]. Crop Science, 1982, 22(4): 833-835.

[14] Duan Y X, Zheng Y N, Chen L J, et al. Effects of abiotic environmental factors on soybean cyst nematode[J]. Agricultural Sciences in China, 2009, 8(3): 317-325.

[15] Yu Q, Potter J W. Selective nematicidal activity of nicotine[J]. Journal of Food, Agriculture & Environment, 2008, 6(3 & 4): 428-432.

[16] Sardanelli S, Kenworthy W J. Soil moisture control and direct seeding for bioassay of Heterodera glycines on soybean[J]. Journal of Nematology, 1997, 29(4S): 625-634.

[17] Singh M, Sharma S B. Infectivity, development, and reproduction of Heterodera cajani on pigeonpea: influence of soil moisture and temperature[J]. Journal of Nematology, 1995, 27(3): 370-377.

[18] Rebosis R V. Effect of soil water on infectivity and development of Rotylenchulus reniformis on soybean, Glycine max[J]. Journal of Nematology, 1973, 5(4): 246-249.

[19] 杨卫星，袁虹霞，邢小萍，等. 土壤质地组分及含水量对小麦禾谷胞囊线虫病发生的影响[J]. 河南科学，2008，26（6）：672-675.

[20] 赵洪海，丁海燕，彭德良. 胶州市小麦禾谷孢囊线虫群体动态的年度间差异[J]. 麦类作物学报，2014，34（4）：563-567.

[21] 齐娜伟，赵洪海. 2014 年气象条件对大豆孢囊线虫田间侵染进程的影响分析[J]. 山东农业科学，2015，47（5）：81-85.

Comparison of the Infection Characteristics of Tobacco-infecting Cyst Nematode among Three Soil Moisture Conditions

XU Guantang, ZHAO Honghai*

(College of Agronomy and Plant Protection, Qingdao Agricultural University, Key Laboratory of Integrated Crop Pest Management of Shandong Province, Qingdao 266109, China)

The purpose of this study was to investigate the effects of soil moisture on the infection of tobacco-infecting cyst nematode (Heterodera glycines, HGT). In the study, quantitative inoculation and cup experiment were conducted, and population densities and dynamics of different HGT developmental stages under three soil moisture treatments, the low one with the moisture volume percentage (MVP) of 3%-9%, the middle one with the MVP of 15%-25% and the high one with the MVP of 30%-40%, were ascertained through periodical sampling and microscopic examination of the juveniles, white females and newly-formed cysts extracted from soil and the juveniles stained in tobacco roots. The results showed that the emergence in soil and penetration to root of HGT 2nd stage juveniles were both inhibited, and the developmental quantities and processes of the 3rd and 4th stage juveniles were obviously decreased and delayed under the low moisture treatment as compared with the middle one. The penetration to root of the 2nd stage juveniles were speeded up and the development of the 3rd and 4th stage juveniles occurred ahead of time under the high moisture treatment as compared with the middle one. The reproduction factors (Rf) of HGT were 0.7, 1.0 and 0.4 under the low, middle and high moisture treatments, respectively. It could be concluded that both too low and excessive soil moistures were unfavorable for the normal infection of HGT, and excessive moisture inhibited the reproduction of HGT more obviously.

tobacco-infecting cyst nematode; moisture treatment; developmental process; reproduction factor

S435.72

1007-5119（2016）06-0055-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.06.010

国家公益性行业（农业）科研专项（201503114）；青岛农业大学大学生科研创新项目（2014-193）；山东省普通本科高校应用型人才培养专业发展支持计划项目（lj20141811）

许冠堂（1994-），男，本科，从事孢囊线虫研究。E-mail：2389996818@qq.com。*通信作者，E-mail：hhzhao@qau.edu.cn

2016-02-17

2016-07-18