缺血性脑卒中急性期血清脑特异性miRNAs水平的变化及与炎症应答和梗死体积的相关性

李　松

四川达州市中西医综合医院检验科　达州　635000

缺血性脑卒中急性期血清脑特异性miRNAs水平的变化及与炎症应答和梗死体积的相关性

李松

四川达州市中西医综合医院检验科达州635000

【摘要】目的探讨缺血性脑卒中急性期血清脑特异性miRNAs水平的变化及其与炎症应答和梗死体积的相关性。方法收集起病24 h内的缺血性脑卒中患者22例及健康对照8例，收集临床资料，NIHSS评分评估神经功能缺损，MRI检查评估梗死体积。于卒中起病24 h内(22例)及48 h内(6例)采取静脉血，分离血清。结果卒中起病24 h内血清miRNA-124水平显著下降，起病48 h内血清miRNA-219水平较起病24 h内有所升高。卒中起病24 h内血清miRNA-124、miRNA-9、miRNA-219水平均与梗死体积呈负相关，血清miRNA-9水平与入院时及入院24 h NIHSS评分呈负相关。结论脑特异性miRNAs参与调节缺血性脑卒中急性期炎症应答水平，血清miRNA-124、miRNA-9、miRNA-219水平降低加剧炎症反应及脑组织炎症损伤。

【关键词】缺血性脑卒中；梗死体积；血清脑特异性miRNAs；MMP-9；hs-CRP

目前脑血管病已成为我国城市和农村人口的第1位致残和死亡原因，且发病有逐年增多的趋势，严重威胁人类健康及生存质量，给社会和家庭造成沉重的经济负担。全国第3次死因回顾抽样调查显示，中国的脑卒中发病率较发达国家高4～5倍，其中70%以上为缺血性脑卒中[1]。一系列临床前研究和临床研究证明，靶向作用于炎症反应的神经保护治疗可避免缺血半暗带区的细胞死亡，改善卒中患者的神经功能和预后。自2008年Lawrie等[2]在人类血清中首次检测到miRNAs，并发现弥漫性大B细胞淋巴瘤患者血清miRNA-2l表达上调，此后不少学者采用各种方法在健康人群以及各种疾病患者的血浆或血清中检测到多种miRNAs，并发现在不同的疾病中有各自特异的循环miRNAs的表达谱[3]。分析血清脑特异性miRNAs水平与患者脑梗死体积和炎症应答水平的相关性，及其对患者神经功能的影响，以期发现对缺血性脑卒中的诊断及预后敏感性和特异性均较高的实验室指标。

1材料与方法

1.1实验材料临床资料：此研究共收入22例急性缺血性脑卒中患者及8例健康对照。病例组为2012-06-2013-03我院神经内科就诊的急性缺血性脑卒中患者，纳入标准：(1)临床确诊为急性缺血性卒中，入院前头部CT排除脑出血；(2)于卒中发病24h内入院；(3)能接受MRI检查(无MRI检查禁忌证)。排除标准：(1)年龄<18岁；(2)接受过溶栓治疗或目前正在使用抗凝药物；(3)颅内出血或合并梗死后出血；(4)合并任何其他神经系统疾病或精神疾病；(5)合并肿瘤；(6)合并自身免疫性疾病；(7)研究期间出现感染相关的临床症状。入组患者及健康对照均由本人或法定监护人签署知情同意书。由1名熟练的神经内科医师采用美国国立卫生研究院卒中量表(NationalInstituteofHealthStrokeScale，NIHSS)对患者入院时、入院24h后及入院7d后的神经功能缺损程度进行评估。收集病例组的临床资料，包括起病时间、基线NIHSS评分、年龄、性别、高血压、吸烟、糖尿病、房颤、血脂紊乱、冠心病、既往卒中史等。

1.2实验方法病例采集，收集血液标本：所有入组患者均于起病24h内采取静脉血1次，其中6例于第1次采血24h后(即起病48h内)接受第2次采血。以肘正中静脉为穿刺部位，由1名熟练的护士采取静脉血5mL，采用不添加任何抗凝剂和促凝剂的血清分离管(红管)收集血液标本。因溶血会影响循环中某些miRNAs的含量[4]，采取静脉血后不颠倒采血管，标本转运途中尽量减少颠簸，以避免溶血。

MRI评估梗死体积：所有入组患者入院后均至我院医学影像科接受头部MRI检查，MRI仪器型号为MagnetomTrioTim3.0T。扫描序列包括T1、T2、T2FLAIR、MRA、DWI，扫描层厚为6mm，扫描层间距为7.8mm。扫描图像上传到PACS系统。采用ImageJ2.1.4.6软件对每个梗死层面进行分析，手绘出DWI序列上的高信号区域，由软件自动计算出高信号区域对应的面积。采用如下公式计算梗死体积：梗死体积=各梗死层面DWI高信号区域面积之和×(扫描层厚+扫描层间距)。血清总RNA提取：血清总RNA的提取参照TrizolLS(Invitrogen公司)说明书进行，分光光度法检测所提取RNA的浓度和纯度，本实验所提取RNA的A260/A280>1.8。

SYBR法实时定量PCR：反应步骤严格按照Takara公司OneStepPrimeScript®miRNAcDNASynthesisKit及SYBR®PremixExTaqTMⅡ试剂盒说明书进行。熔解曲线为锐利的单峰则结果可信。读取每孔的CT值，以cel-miRNA-39为参照，采用2-△△Ct法[40]评定每个样本中相应miRNA分子的含量。

ELISA检测血清MMP-9浓度：实验步骤按照MMP-9ELISA试剂盒说明书进行采用CurveExpert1.4软件进行标准曲线的拟合，然后利用此标准曲线计算每个血清样本MMP-9的浓度。

血浆hs-CRP浓度的检测：患者入院后，于卒中起病24h内采取静脉血3mL送至中南医院检验科，采用透射免疫比浊法测定血浆hs-CRP浓度，试剂盒由西门子提供，由西门子BNP全自动特定蛋白仪完成。

1.3统计学分析此研究涉及到的所有统计学分析均由SPSS19.0完成。首先对连续变量资料如血清miRNAs水平、MMP-9含量、hs-CRP含量、梗死体积和NIHSS评分进行正态分析，对符合正态分布的资料采用参数t检验，对不符合正态分布的资料采用Kruscal-Wallis与Mann-WhitneyU 检验或Wilcoxon秩和检验。采用受试者工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve，ROC曲线) 分析检测指标的诊断价值。采用Spearman-Rho检验分析检测指标间的相关性。所有检验均为双侧，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1血清中可稳定检测到脑特异性miRNAs本研究采用TrizolLS提取血清中总RNA，然后采用加尾法反转录及SYBR法荧光定量PCR可以稳定检测到miRNA-124、miRNA-9、miRNA-219的扩增。尽管部分标本CT值超过30，但熔解曲线均为锐利的单峰，表明本研究采用的方法体系具有较高的特异性。图1为1例健康志愿者血清cel-miRNA-39及miRNA-124、miRNA-9、miRNA-219的扩增曲线和熔解曲线。

图11例健康志愿者血清外参及脑特异性miRNAs的扩增曲线和熔解曲线上2排：扩增曲线依次为：cel-miRNA-39、miRNA-124、miRNA-9、miRNA-219下2排：熔解曲线依次为：cel-miRNA-39、miRNA-124、miRNA-9、miRNA-219

2.2缺血性脑卒中急性期血清脑特异性miRNAs水平变化卒中起病24h内患者血清脑异性miRNAs水平变化：卒中起病24h内，在所检测的3种脑特异性miRNAs中，只有血清miRNA-124水平较健康对照组明显降低(P=0.002)(图2a)，血清miRNA-9水平与健康对照组相比差异无统计学意义(图2b)，血清miRNA-219水平较健康对照组有下降趋势(P=0.095)(图2c)。其中血清miRNA-124水平对于诊断急性缺血性脑卒中的ROC曲线下面积为0.792(95%可信区间0.627～0.956，P=0.017)，此时诊断的敏感性为76.2%，特异性为87.5%。

卒中起病48h内患者血清脑异性miRNAs水平变化：本研究同时检测了6例患者卒中起病48h内血清中3种脑特异性miRNAs的水平。与卒中起病24h内的血清miRNAs水平相比，血清miRNA-124(图2d)和miRNA-9(图2e)水平无明显变化，而血清miRNA-219水平较卒中起病24h内有所上升(P=0.028)(图2f)。

图2缺血性卒中急性期血清脑特异性miRNAs水平上排：病例组(卒中起病24h内)vs健康对照组：(a)miRNA-124(b)miRNA-9(c)miRNA-219下排：卒中起病24h内vs卒中起病48h内：(d)miRNA-124(e)miRNA-9(f)miRNA-219

3讨论

目前循环miRNAs的定量检测缺乏一致公认的内参分子，既往多采用U6、RNU6B、18S或miRNA-16等作为内参。然而U6和RNU6B并非miRNAs，它们的提取、反转录和PCR扩增效率可能与miRNAs有差异，因此U6和RNU6B作为循环miRNAs检测的内参目前存在争议[5]。而循环miRNA-16水平受溶血影响[6]，且某些肿瘤患者体内的循环U6、miRNA-16的含量会发生变化[7-8]。因此，本研究于RNA提取之前加入cel-miRNA-39作为外参，以消除不同样本之间RNA提取率的差异，使得不同样本之间的比较具有较高的可信性。

本研究发现，缺血性脑卒中急性期血清miRNA-124水平较健康对照组明显下降，血清miRNA-219水平有下降趋势，亚组分析显示血清miRNA-9水平在大面积脑梗死患者中也有所下降。本研究结果与上述动物模型研究结果的差异可能由下列方法学上的区别所致：(1)上述动物研究在血液标本的处理过程中，均未进行14 000～16 000g的高速离心。脑组织缺血缺氧后脑细胞死亡，释放大量细胞碎片、凋亡小体等，同时血脑屏障通透性增高，使得这些物质较易穿过血脑屏障进入到循环中，导致所获得的血浆样本中含有较多的坏死细胞、细胞碎片、凋亡小体等，如前所述这些结构中含有大量miRNAs，使所检测到的循环miRNA水平较高。由于血脑屏障破坏的程度与梗死体积并不成正比，因此血浆miRNA-124含量与大鼠脑梗死体积之间不存在相关性。(2)本研究所检测的标本为血清，而上述动物研究所检测的标本为血浆。在循环miRNAs的检测中，标本处理过程中的高速离心步骤对血浆miRNAs含量的影响大于血清。McDonald[6]等发现对于同一健康志愿者，血浆中所检测miRNAs的含量明显高于血清；当对血浆和血清标本进行15 000g的高速离心处理后，血浆中所检测miRNAs的含量的下降程度明显高于血清，高速离心可以消除血浆和血清miRNAs含量的差异。

由于本文在血清样本处理过程中采用高速离心步骤去除了细胞碎片、凋亡小体、血小板和大囊泡等的干扰，本研究中检测到的血清脑特异性miRNAs应以微小泡形式或AGO蛋白结合形式存在。如前所述，非微小泡包被的miRNAs主要来自细胞坏死后胞浆的被动释放，若血清脑特异性miRNAs以AGO蛋白结合形式存在，理论上缺血性脑卒中急性期其含量会升高。然而本研究中，缺血性卒中急性期血清miRNA-124水平明显下降，血清miRNA-219水平有下降趋势，血清miRNA-9水平在大面积脑梗死患者中也有所下降；并且血清中3种脑特异性miRNAs的水平均与炎性因子水平呈负相关，提示这些血清miRNAs具备一定生理活性，能够参与调节炎症反应。目前并没有哺乳动物中Ago-miRNA复合物参与调节细胞间信息交换的相关报道，而微小泡形式的miRNAs则具备这些生理功能[9]。据此本文推测，本研究中检测到的血清miRNAs可能主要以微小泡形式存在，但目前并无生理和病理状态下血清脑特异性miRNAs存在形式的相关研究。

综上所述，缺血性脑卒中急性期血清脑特异性miRNAs水平下降，并与炎性因子MMP-9水平和梗死体积呈负相关，其中血清miRNA-9水平与神经功能缺损程度呈负相关。这些miRNAs可能以微小泡形式存在，并具有生理功能，能够抑制缺血性脑卒中急性期过度的炎症反应。然而，这些miRNAs的来源、在循环中的存在形式、动态变化及治疗价值有待更深入的研究，本研究结果也有待更大样本的临床试验予以证实。

4参考文献

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[2]LawrieCH，GalS，DunlopHM，etal.DetectionofelevatedlevelsoftumourassociatedmicroRNAsinserumofpatientswithdiffuselargeB-celllymphoma[J].BrJHaematol，2008，141(5)：672-675.

[3]WeilandM，GaoXH，ZhouL，etal.SmallRNAshavealargeimpact：CirculatingmicroRNAsasbiomarkersforhumandiseases[J].RNABiology，2012，9(6)：850-859.

[4]MichaelaB.Kirschner，StevenC，etal.HaemolysisduringsamplepreparationaltersmicroRNAcontentofplasma[J].PlosOne， 2011，6(9)：e24 145.

[5]ZhuHT，DongQZ，WangG，etal.IdentificationofSuitableReferenceGenesforqRT-PCRAnalysisofCirculatingmicroRNAsinHepatitisBVirus-InfectedPatients[J].MolBiotechnol，2012，50(1)：49-56.

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[8]AppaiahHN，GoswamiCP，MinaLA，etal.PersistentupregulationofU6：SNORD44smallRNAratiointheserumofbreastcancerpatients[J].BreastCancerRes， 2011，13(5)：R86.

[9]LiangY，RidzonD，WongL，etal.CharacterizationofmicroRNAexpressionprofilesinnormalhumantissues[J].BMCGenomics，2007， 8：166.

(收稿2015-06-11)

ChangesofthelevelsofserumspecificmiRNAsatacutestageofcerebralischemicstrokeanditscorrelationwithinflammatoryresponseandinfarctionvolume

Li Song

Department of Laboratory， the Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital of Dazhou City， Dazhou 635000， China

【Abstract】Objective To evaluate the changes of the levels of serum specific miRNAs at acute stage of cerebral ischemic stroke and its correlation with inflammatory response and infarction volume. Methods Clinical data from 22 consecutive patients with acute ischemic stroke within 24h after symptom onset and 8 healthy controls were retrospectively enrolled. Neurological function deficit was assessed by the National Institute of Health Stroke Scale (NIHSS) and infarction volume was evaluated by MRI. Venous blood was collected and serum was isolated from each patient within 24h (22 cases) and 48h (6 cases) after stroke onset. The levels of serum miRNA were detected by RT-PCR and the level of MMP-9 by ELISA. Results The levels of serum miRNA-124 within 24h after stroke onset were significantly decreased. The level of serum miRNA-219 within 48h after stroke significantly rose up compared to that within 24h. The levels of all the three miRNAs (miRNA-124， miRNA-9， miRNA-219) detected within 24h after stroke onset were negatively correlated with infarction volume. Additionally， the level of serum miRNA-9 had negative correlation with NIHSS scores at admission and at 24 hours. Conclusion Brain specific miRNAs are involved in the regulation of inflammatory response in acute ischemic stroke. The lower levels of serum miRNA-124， miRNA-9 and miRNA-219 can aggravate inflammatory response and exacerbate cerebral injury.

【Key words】Ischemic stroke； Infarction volume； Serum specific miRNAs； MMP-9； hs-CRP

【中图分类号】R743.33

【文献标识码】A

【文章编号】1673-5110(2016)10-0007-03