Urovysion FISH检测尿液泌尿道肿瘤相关基因的异常及在老年科体检中的应用

李　莉,徐　苓,谢国化,王根发,张　良

(上海交通大学医学院附属新华医院:1.检验科;2.老年医学科;3.泌尿外科　200092)

·论著·

Urovysion FISH检测尿液泌尿道肿瘤相关基因的异常及在老年科体检中的应用

李莉1,徐苓1,谢国化1,王根发2,张良3△

(上海交通大学医学院附属新华医院:1.检验科;2.老年医学科;3.泌尿外科200092)

摘要:目的了解基于Urovysion荧光原位杂交技术(FISH)检测尿液脱落细胞中泌尿系统恶性肿瘤相关性染色体异常在老年科体检中的应用价值。方法收集1 350例老年科患者的晨尿，采用Urovysion FISH检测尿液细胞中第3、7、17号染色体的非整数倍，以及第9号染色体长臂21区域的缺失。结果1 350例患者中共检测出3号染色体异常55例(4.07%)，7号染色体异常68例(5.04%)，17号染色体异常41例(3.04%)，9号染色体异常36例(2.67%)。经病理证实为膀胱癌22例(1.63%)，其他泌尿系统恶性肿瘤16例(1.19%)。结论Urovysion FISH对于泌尿系统恶性肿瘤的早期诊断有较高的应用价值，可以作为老年科泌尿系肿瘤筛查的一线方法。

关键词:泌尿系肿瘤;荧光原位杂交;尿液细胞学

泌尿道肿瘤中膀胱癌是老年人群中发病率较高的恶性肿瘤，根据美国癌症学会的最新统计资料显示，2012年全球膀胱癌新发病例42.98万例，死亡病例16.51万例。男女比例为10∶1，因而膀胱癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤[1]。 膀胱癌的早期诊断对疾病的预后有极其重要的影响，早期诊断主要以尿液脱落细胞学诊断、膀胱镜组织活检病理学检查及影像学检查等方法为主。 近期一种基于荧光原位杂交技术(FISH)原理的检测技术已经应用到临床实践中，此项技术主要检测尿液标本中第3、7、17号染色体的非整数倍，以及第9号染色体长臂21区域(9p21)的缺失。根据国外文献报道显示，FISH对泌尿系肿瘤的诊断有较高的敏感度和特异性，同时对肿瘤的疗效和预后判断有较好的效果。 本文采用Urovysion FISH试剂盒检测老年科患者泌尿系统脱落细胞中4种染色体的异常，评价FISH在老年人群中普查泌尿系肿瘤的意义，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料收集本院2011年3月至2014年10月老年医学科患者1 350例，其中男965例(71.48%)，女385例(28.52%)，平均年龄(72.3±12.3)岁。

1.2标本采集与制备所有参试者均于试验当天取晨尿30～200 mL，置清洁容器中送至本院实验室待检。行初步尿液脱落细胞计数，如尿液脱落细胞数过少，则判定为不合格标本，嘱患者第2周再送尿液标本。 所有标本均于当天进行处理。

1.3FISH检测FISH检测按Pathvysion Urovysion DNA Kit试剂盒(USA)说明书操作,简要描述如下。将20～50 mL新鲜尿液以2∶1比例与聚乙二醇混合，存放于4 ℃冰箱中当天处理。 将尿液置500 r/min离心10 min以取得泌尿道脱落细胞。用甲醇、冰醋酸混合液固定后2次离心沉淀，将沉淀的细胞用15 μL固定液重悬浮，制成细胞涂片。荧光探针包括3个重复序列，分别可以识别3、7和17号染色体的着丝粒片段。另有一特殊探针识别9p21片段。 在37 ℃潮湿环境下过夜完成杂交,冲洗后空气干燥，然后用4′、6′-二脒基-2-苯基吲哚Ⅱ进行反染色，随后上荧光显微镜分析结果。

1.4FISH结果判断对至少25个形态学异常的细胞进行分析，直至出现大于或等于4个细胞获得复染色体，即CEP3-红色，CEP-7绿色，CEP-17蓝绿色信号的异常；或者出现大于或等于12个细胞具有9p21片段的同源缺失(即LSI 9p21黄色信号的缺失)。

2结果

2.1FISH检测尿液中脱落细胞染色体异常的方法验证首先验证了Urovysion FISH在尿液脱落细胞中检测染色体异常的准确性，结果显示，FISH能够准确检测出尿液脱落细胞中3、7、17号染色体的异常，以及9p21区段的缺失。4种染色体异常的荧光显微镜下表现见图1。图1A为正常尿液脱落细胞FISH结果，表现为红色、绿色、蓝绿色及黄色各2个信号； 图1 B为FISH阳性结果，表现为3、7、17号染色体多重信号增加；图1C为7号染色体异常结果，表现为绿色信号缺失；图1D为17号染色体异常，表现为蓝绿色信号缺失；图1E为9p21缺失异常，表现为黄色信号缺失； 图1F为3号染色体异常，表现为红色信号缺失。

图1　　泌尿道脱落细胞FISH检测结果

2.21 350例老年患者尿液脱落细胞中染色体异常结果分析 Urovysion FISH检测老年科患者尿液脱落细胞染色体正常1 112例(82.37%)，异常238例(17.63%)，其中3号染色体异常55例(4.07%)，7号染色体异常68 例(5.04%)，17号染色体异常 41例(3.04%)，9p21缺失36例(2.67%)。病理学确诊膀胱癌 22例(1.63%)，其他泌尿系肿瘤16例(1.19%)。

3讨论

目前，膀胱癌的确诊主要以膀胱镜活检、影像学表现及最终病理学诊断等手段，为临床医生提供准确的病例类型和临床分期。 FISH检测尿液脱落细胞学，分析膀胱上皮细胞中染色体的异常，可为膀胱癌的早期诊断提供重要的线索和依据。并且是一种无创性诊断方法，获得了美国食品药品监督管理局和国家药监局批准，用于普通人群膀胱癌的筛选检查。

FISH的特点是方法稳定，可以避免标本处理和固定过程中的影响因素。 其另一个优点是能对结果直接进行定性和定量分析，受观察者主观因素的影响较小。 本研究晨尿中脱落细胞的数量决定了分析结果的可靠性。因而细胞数量低于分析前要求，本研究采取了重新采样的做法，以确保检验结果的准确性。

本研究结果显示，FISH检测尿液脱落细胞染色体异常产生了较为满意的敏感度和特异性,与国外的报道结果相类似[2-4]。 3、7、17号染色体倍体异常，以及9p21区段的缺失在膀胱癌中呈现较高的发生率。Kim等[5]的研究结果显示，尿液脱落细胞FISH阳性结果可以预测尿液细胞学可疑及膀胱镜检阴性的膀胱癌患者的复发和肿瘤进展，但需要的随访时间较长;阳性FISH结果预测复发的风险比(HR)=2.35,95%CI:1.42～3.90,P=0.001,预测肿瘤进展的HR=3.01,95%CI:1.10～8.21,P=0.03。在另一项前瞻性筛选研究中，Bonberg等[6]报道，染色体的不稳定性与膀胱癌的发生密切相关，3、7、17号染色体的多倍体异常，以及9p21位点的缺失是膀胱癌最为常见的拷贝数变异(CNV )表现，此类异常具有累积性，且在肿瘤获得诊断前3年即可被发现；高分化性肿瘤比低分化性肿瘤有更高的累计性CNV。Urovysion FISH也可以检测上泌尿道脱落细胞中染色体的异常，Reynolds等[7]报道,相对于尿液细胞学检查，FISH有更高的检测敏感度和特异性，而二者联合应用可以显著提高诊断的准确性。 Urovysion FISH在非肌肉侵袭性膀胱癌的预后评估中具有显著意义,在多变量分析模型中均值大于16%的CNV是膀胱癌的预后影响因子(P=0.048,OR:6.07,95%CI:1.02～57.45)[8]。同时9p21缺失大于12%是预后的独立影响因子(P<0.001,OR:3.24,95%CI:1.85～5.62)。

综上所述，UroVysion FISH适合在一般老年人群中作为一种普查试验来筛选膀胱恶性肿瘤，并且可以提前数年为临床医生提供诊断的线索，避免侵入性的检查方法。 同时可以作为膀胱癌预后判断的一种有效方法。

参考文献

[1]Torre LA,Bray F,Siegel RL,et al.Global cancer statistics,2012[J].CA Cancer J Clin,2015,65(2):87-108.

[2]Somoza AD,Aly FZ.Utility of molecular tests in cytopathology[J].Cytojournal,2014,20(11):5-12.

[3]Dimashkieh H,Wolff DJ,Smith TM,et al.Evaluation of urovysion and cytology for bladder cancer detection:a study of 1835 paired urine samples with clinical and histologic correlation[J].Cancer Cytopathol,2013,121(10):591-597.

[4]Ho CC,Tan WP,Pathmanathan R,et al.Fluorescence-in-situ-hybridization in the Surveillance of Urothelial Cancers:Can Use of Cystoscopy or Ureteroscopy be Deferred?[J].Asian Pac J Cancer Prev,2013,14(7):4057-4059.

[5]Kim PH,Sukhu R,Cordon BH,et al.Reflex fluorescence in situ hybridization assay for suspicious urinary cytology in patients with bladder cancer with negative surveillance cystoscopy[J].BJU Int,2014,114(3):354-359.

[6]Bonberg N,Pesch B,Behrens T,et al.Chromosomal alterations in exfoliated urothelial cells from bladder cancer cases and healthy men:a prospective screening study[J].BMC Cancer,2014,14(20):854-860.

[7]Reynolds JP,Voss JS,Kipp BR,et al.Comparison of urine cytology and fluorescence in situ hybridization in upper urothelial tract samples[J].Cancer Cytopathol,2014,122(6):459-467.

[8]Matsuyama H,Ikemoto K,Eguchi S,et al.Copy number aberrations using multicolour fluorescence in situ hybridization (FISH) for prognostication in non-muscle-invasive bladder cancer (NIMBC)[J].BJU Int,2014,113(4):662-667.

Application of Urovysion FISH in the detection of aberrant chromosomes of urothelial malignancies:a study of geriatric patients by detecting urine specimens

LILi1,XULing1,XIEGuohua1,WANGGenfa2,ZHANGLiang3△

(1.DepartmentsofClinicalLaboratory; 2.DepartmentofGerontology,XinHuaAffiliatedHospitalofShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200092,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the clinical application values of Urovysion fluorescent in situ hybridization (FISH) in the detection of aberrant chromosomes of urothelial malignancies in exfoliated urothelial cells of geriatric patients.MethodsMorning urine samples from 1 350 cases of geriatric patients were collected.The aberrant chromosomes 3,7 and 17 aneuploidy and 9p21 locus deletions were tested with Urovysion FISH assay.ResultsIn total of 1 350 cases,55 cases (4.07%) were detected as chromosome 3 anueploidy; 68 cases (5.04%) were detected as chromosome 7 aneuploidy; 41 cases (3.04%) were detected as chromosome 17 anueploidy and 36 cases (2.67%) were detected as 9p21 locus deletions.The final pathologic diagnosis confirmed that 22 cases(1.63%) were bladder cancer and 16 cases (1.19%) were other urothelial carcinomas.ConclusionUrovysion FISH has high application value for the screening of urothelial malignancies and can be used as routine diagnostic method.

Key words:urothelial malignancy;fluorescent in situ hybridization;urinary cytology

作者简介：李莉，女，主管技师，主要从事分子生物学检验方面的研究。△通讯作者，E-mail:drliangz@126.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.11.008

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)11-1470-02

(收稿日期：2016-01-12修回日期：2016-03-12)