抗增殖蛋白与糖代谢和脂肪代谢关系的研究进展

方 雯，冯 红

(天津体育学院健康与运动科学系 天津300381)

科技评论

抗增殖蛋白与糖代谢和脂肪代谢关系的研究进展

方 雯，冯 红*

(天津体育学院健康与运动科学系 天津300381)

抗增殖蛋白(又称Prohibitin，PHB)作为一种在进化上高度保守的蛋白，广泛分布于细菌、酵母、果蝇、原虫及哺乳类多种生物细胞中。抗增殖蛋白具有功能多样性，主要由核基因编码，定位于线粒体内膜、细胞核、细胞膜和基质中。由于其在线粒体上的特殊定位、结构和功能，已引起广泛关注。近年来，在与线粒体功能相关的研究中开始逐渐成为新的热点，包括维持线粒体形态功能，参与调解线粒体能量代谢等。针对抗增殖蛋白与线粒体的相关研究，阐述其在线粒体糖代谢和脂肪代谢中的重要作用，进一步说明抗增殖蛋白与能量代谢的关系。

抗增殖蛋白(Prohibitin) 线粒体 糖代谢 脂肪代谢

抗增殖蛋白(Prohibitin，PHB)在线粒体中普遍存在，是一种在进化上保守性很强的蛋白。真核生物线粒体PHB复合体由两个高度相似的亚基组成，即：PHB1和PHB2(大约有50%,～60%,的氨基酸顺序一致)。PHB主要定位于线粒体内膜、细胞核、细胞膜和基质中，[1-2]由于其结构上的保守性和功能上的多样性，决定了其具有生物学功能的多样性。在细胞的正常状态下，抗增殖蛋白可通过调控转录因子E2F参与抑制细胞周期。[3-5]截至目前，已知PHB与调控细胞周期增殖，调控细胞分化、凋亡，维持线粒体结构和功能，参与调控线粒体能量代谢以及与衰老、糖尿病、肝病、肿瘤等疾病有紧密关系。本文结合国内外相关研究，从PHB与糖代谢、脂肪代谢关系的角度进行总结，进而对PHB与能量代谢的关系开展深入研究。

1 PHB的命名和分类

1989年，McClung等[6]首先从老鼠的肝脏细胞中克隆出PHB基因，目前发现的PHB基因包括PHB1和PHB2两种亚型。[7]随后Nuell等(1991)将PHB基因通过显微注射进入正常人的成纤维细胞中，发现DNA的合成被PHB mRNA所抑制，得出PHB具有抗细胞增殖的作用，因而有了抗增殖蛋白这个名字。Sato等(1992)发现PHB基因位于染色体17q12-q21上。其中，PHB1和PHB2的相对分子质量分别为为32 kD和37 kD。[8-9]PHB基因家族除上述2个基因外，还包括4个假基因，分别位于6q25、11p11、1p31和2q21。

2 PHB的结构和定位

在细胞核内，PHB作为一种核基因编码的蛋白质，通过调控转录因子E2F，起着负向调节细胞周期的作用，[10-13]并且在B细胞内参与细胞的早期信号传递。[14]研究发现，PHB的氨基酸结构非常保守，其氨基酸序列与许多生物都具有高度的同源性，[1]在细胞内单体形式的PHB很快被降解，因而主要以复合物形式存在。对PHB1和PHB2这两个亚型进行结构分析，发现其氨基酸序列具有高度的同源性(见图1)。PHB复合体可锚定于线粒体内膜上，通过分子伴侣作用与线粒体内新合成的多肽链相结合，并在折叠酶的作用下完成正确的空间折叠。[9,15-16]PHB也存在于细胞核内，发挥着负性转录调控作用。多数PHB复合体的相对分子量约为1 mD，由12～16对由PHB1和PHB2构成的异源性二聚体，组成一个环形栅栏结构。[17-18]

图1 人类PHB1和PHB2氨基酸序列排布Fig.1 Acid sequence of PHB1 and PHB2 in human bodies

3 PHB对糖代谢的影响

在脂肪细胞中，PHB1能调控葡萄糖的运输和氧化。在脂肪细胞中脱氧葡萄糖的基本吸收速率为4.1±0.9 nmol.(g fat tissue)-1(15 min)-1。当胰岛素刺激时，脱氧葡萄糖吸收速率约为基本吸收速率的2.5倍。用14C标记葡萄糖培养脂肪细胞，胰岛素刺激14CO2生成，研究结果发现PHB1对丙酮酸羧化酶的抑制效果十分显著。与之相比，当缺乏胰岛素或丙酮酸时，由于草酰乙酸已耗尽，油酸发生了最小程度的氧化。当脂肪组织中的葡萄糖被耗尽时，胰岛素对标记含有14C的油酸生成CO2有适当的调节作用(约为基本吸收速率的1.5倍，p＜0.05)。PHB1可以抑制此种调节作用。单独添加丙酮酸对CO2生成的影响程度最小。然而，在胰岛素作用下，丙酮酸加强了油酸的氧化。葡萄糖耗尽时，胰岛素诱导油酸氧化的强化可能在于丙酮酸的草酰乙酸已经饱和，PHB1的抑制作用非常显著。同时，PHB1对丙酮酸羧化酶的抑制使得三羧酸循环的原料草酰乙酸的来源减少，因而调节细胞代谢由氧化磷酸化向糖酵解路径转变。[19]此外，在研究TCM62缺陷的酿酒酵母突变体中发现了PHB1在糖代谢过程中的作用。[20]PHB1在许多癌细胞中出现过表达，[21]并且被证实在癌症病人的体内呈聚集增多现象。[22]相比正常细胞，无氧糖酵解水平的增加正是大多数肿瘤细胞的代谢特点之一。Nijtmans和他的同事[11]提议PHB1在癌细胞中的表达上调是由于在PHB1的启动中存在调控因子，并且结合了原癌基因的肿瘤蛋白。在肿瘤细胞中上调原癌基因的表达，诱导PHB1的表达增多。[23]Nijtmans等人认为，通过原癌基因增加PHB1的表达，也可诱导糖分解酶的表达和运送蛋白参与碳水化合物的代谢，并在无氧酵解的情况下降低氧化应激作用。总之，PHB1是一个抑制丙酮酸羧化酶的蛋白，同时可能参与了新陈代谢的氧化磷酸化朝着无氧酵解转化的机制。

综上所述，PHB1抑制丙酮酸羧化酶，改变新陈代谢，远离氧化磷酸化朝着无氧酵解的方向发展。所以，PHB的表达增多，诱导糖分解增多，线粒体能量代谢增强。

4 PHB对脂肪代谢的影响

PHB1隐藏在脂肪组织的脂肪滴和整个三羧酸循环中，可作为丙酮酸羧化酶(PC)的抑制剂。在脂肪组织中，它的功能是作为膜受体及线粒体的结合伴侣被靶定。因此，它可以调节胰岛素刺激葡萄糖的脂肪酸氧化。

4.1 PHB调节脂肪细胞的分化、增殖和凋亡

研究发现，PHB存在于脉管中白色脂肪组织比较丰富的部位，抑制小鼠3T3-L1 前脂肪细胞的分化和增殖，同时调节脂肪细胞的凋亡。[24]3T3-L1前脂肪细胞脂肪分化过程中，细胞新陈代谢旺盛，线粒体形态改变，而线粒体中PHB 表达显著增加。[25-26]因此，PHB 在 3T3-L1前脂肪细胞分化中起着非常重要的作用。miR-27可作用于PPARγ抑制脂肪的形成，但生物信息学分析发现，miR-27更易结合PHB。故miR-27主要是通过结合PHB，诱使脂肪形成减少以及线粒体功能障碍。而油红O染色同样证明，过表达PHB可以不同程度地促进脂质的形成。由此可知，过表达PHB可以部分修复脂肪分化过程中由miR-27引起的脂肪分化抑制。

4.2 PHB调节脂肪发育

将 PHB mRNA 注入成人纤维细胞中，发现成纤维细胞的细胞周期不能正常完成。线虫成熟早期若缺失PHB，会导致线粒体膜电位以及脂肪含量降低。P53是一种调控细胞衰老、凋亡的基因，参与DNA的修复过程；DNA受损后，PHB能与 P53 结合，阻止DNA复制，引发细胞凋亡。PHB是维持线粒体功能所必需的结构蛋白，可以通过影响线粒体功能调控脂肪的发育。线粒体在维持铁稳态和氧化代谢中至关重要，Festa M等观察到脂肪发育过程中的铁蛋白水平明显升高。铁蛋白增高是抗脂质氧化的表现，因此线粒体保障了脂肪分化的顺利进行。PPARγ是脂肪发育过程中关键的转录因子。PPARγ结合DNA可诱导脂肪分化，但这种结合可被线粒体呼吸抑制剂所抑制。大量研究表明，脂肪细胞分化过程中，细胞代谢活跃，线粒体活动加强。[26]检测3T3-L1细胞分化过程中PHB的mRNA 水平，发现诱导6 h后PHB1和PHB2明显增加，第2天达到顶峰，1～2周降到正常水平。用人造siRNA沉默PHB，发现3T3-L1前脂肪细胞分化受到抑制，线粒体网状结构破坏，线粒体嵴消失，线粒体复合体I活性受损及活性氧的过度生成。[25]通过促进脂肪干细胞分化，同样发现分化过程中PHB的mRNA及蛋白水平明显升高。ASC细胞转染慢病毒Lenti/miR-27后发现，PHB表达受到抑制，线粒体结构被破坏并伴随着膜电位降低、ROS生成量增加等现象。由此可知，PHB是促进脂肪细胞分化的关键介质，也可能成为肥胖症治疗的潜在靶标。

4.3 PHB调节脂肪酸氧化

PHB1通过调控线粒体功能影响细胞氧耗和氧化磷酸化。故在脂肪细胞中，PHB1定位于细胞膜的脂质筏上且能够抑制丙酮酸羧化酶的活性从而调节糖代谢和脂肪酸氧化。［27］体外实验证明，PHB1抑制丙酮酸羧化酶。质谱仪(MALDI-TOF)分析蛋白质鉴定，通过PHB1在脂肪细胞膜上的交联，表明PHB1和丙酮酸羧化酶、EHD2(蛋白抗体)紧密相连。研究表明，通过脂质筏原理和EHD2蛋白抗体将细胞外和线粒体内的PHB1回收利用，并且通过抑制丙酮酸羧化酶可以调节线粒体的能量代谢。PHB1对丙酮酸羧化酶的抑制十分明显，当把PHB1加入到完整的脂肪细胞中，细胞外的PHB1可以被转移到细胞内并且抑制丙酮酸羧化酶。与Kolonin的报道相同，[24]线粒体死亡肽靶定到与PHB1相关的浆膜上，有可能诱导脂肪组织的细胞凋亡。丙酮酸羧化酶主要定位于线粒体基质，附着于线粒体内膜上，[23]并通过乙酰辅酶A和乙酰辅酶A短链的衍生物被激活。PHB1也定位于酵母线粒体内膜上，[28]在哺乳类动物细胞中定位于与线粒体相同的区域。[7]因此，不清楚外源性的PHB1能否抑制丙酮酸羧化酶。在正常情况下，内源性线粒体的PHB1并没有出现这种功能。线粒体PHB1形成一个高分子的环状结构，通过与相关蛋白PHB2紧密相连。但按照复合体形式存在的PHB1不能抑制丙酮酸羧化酶。除丙酮酸羧化酶外，研究认为EHD2蛋白抗体是PHB1的结合伴侣。在3T3L1脂肪细胞的脂滴中鉴定丙酮酸羧化酶、EHD2蛋白抗体和PHB1。研究表明，只有在3T3L1脂肪细胞的脂滴中，PHB1和丙酮酸羧化酶才能被识别。[29]根据观察推测，伴随年龄变化，线粒体氧化磷酸化降低，在衰老过程中增强对丙酮酸羧化酶的抑制与PHB1亚型改变存在关联。随着年龄的增长，PHB1对丙酮酸羧化酶的抑制作用越来越明显，脂肪代谢逐渐减弱，线粒体能量代谢降低。

5 结 语

自20世纪80年代末首次发现PHB以来，科学家们对其一直保持着很高的研究热情。由于功能多样，在多种生物学进程中发挥着独特而重要的作用，特别在人类多种疾病的发生和发展过程中起着至关重要的作用，PHB的作用机制值得人们进行深入研究。本文针对PHB与糖代谢和脂肪代谢的关系进行了阐述，进一步说明PHB与能量代谢的关系。PHB1抑制丙酮酸羧化酶，改变新陈代谢，远离氧化磷酸化朝着无氧酵解的方向发展。所以，PHB的表达增多，诱导糖分解增多，线粒体能量代谢增强。PHB通过抑制丙酮酸羧化酶，使得脂肪代谢逐渐减弱，线粒体能量代谢降低。鉴于能量代谢是和人类息息相关的重要生理过程，PHB与其关系值得进一步深入探讨。

［1］ 陈操，刘欣，孙晶，等. 抗增殖蛋白研究进展[J]. 生命科学，2010，22(5)：405-410.

［2］ Christie D A，Kirchhof M G，Vardhana S，et al. Mitochondrial and plasma membrane pools of stomatin-like protein 2 coalesce at the immunological synapse during t cell activation [J]. PLoS One，2012，7(5)：e37144.

［3］ Joshi B，Ko D，Ordonez-Ercan D，et al. A putative coiledcoil domain of prohibitin is sufficient to repress E2F1-mediated transcription and induce apoptosis[J]. Biochem BiophysRes Commun，2003，312(2)：459-466.

［4］ Nuell M J，Stewart D A，Walker L，et al. PHB，an evolutionarily conserved intracellular protein that block DNA synthesis in normal fibroblasts and Hela cells[J]. Mol CellBiol，1991，11(3)：1372-1381.

［5］ Jupe E R，Liu X T，Kiehlbauch J L，et al. Prohibitin antiproliferative activity and lack of heterozygosity in immortalized cell lines[J]. Exp Cell Res，1995，218(2)：577-580.

［6］ McClung J K，Danner D B，Stewart D A，et al. Isolation of a cDNA that hybrid selects antiproliferative mRNA from rat liver[J]. Eiochem BiophysRes Commun，1989，164(3)：1316-1322.

［7］ 祝丽晶，潘旭东，王翎. 抗增殖蛋白抗肿瘤及衰老的研究进展[J]. 中国老年学杂志，2010，30(11)：3197-3200.

［8］ Sato T，Saito H，Swensen J，et al. The human prohibitin genelocated on chromosome 17q21 is mutated in sporadic breast cancer[J]. Cancer Res，1992，52(6)：1643-1646.

［9］ Nijtmans L G，Artal S M，Grivell L A，et al. The mitochondrial PHB complex：roles in mitochondrial respiratory complex assembly，aging and degenerative disease [J]. CellMol LifeSci，2002，59(1)：143-155.

［10］ Nuell M J，Stewart D A，Walker L，et al. PHB，an evolutionarily conserved intracellular protein that block DNA synthesis in normal fibroblasts and Hela cells[J]. Mol CellBiol，1991，11(3)：1372-1381.

［11］ Roskams A J，Friedman V，Wood C M J，et al. Cell cycle activity and expression of prohibitin mRNA [J]. J Cell Physiol，1993，157(2)：289-295.

［12］ Wang S，Nath N，Fusaro G，et al. Rb and prohibitin target distinct regions of E2F1 for repression and respond to different upstream signals [J]. Mol Cell Biol，1999，19(11)：7447-7460.

［13］ Woodlock T J，Bethlendy G，Segel G B. Prohibitin expression is increased in phorbol ester-treated chornic leukemic B-lymphocytes[J]. Blood CellsMol Dis，2001，27(1)：27-34.

［14］ 郭维. Prohibitin的研究进展[J]. 国外医学：生理、病理科学与临床分册，2005，25(6)：245-257.

［15］ Rajalingam K，Rudel T，Rajalingam K，et al. Ras-Raf signaling needs prohibitin [J]. Cell Cycle，2005，4(11)：1503-1505.

［16］ 付玉，王文迪. 许苏旸，等. 线粒体生物学性状及细胞衰老和运动的影响[J]. 中国组织工程研究，2012，16(11)：1673-8225.

［17］ Back J W，Sanz M A，De J L，et al. A structure for the yeast prohibitin complex：structure prediction and evidence from chemical crosslinking and mass spectrometry[J]. Protein Sci，2002，11(10)：2471-2478.

［18］ Bacher S，Achatz G，Schmitz M L，et al. Porhibitin and prohibitone are contained in high-molecular weight complexes and interact with alpha-actinin and annexin A2[J]. Biochimie，2002，84(12)：1207-1220.

［19］ Aurora P，Stanojevic S，Stocks J，et al. Structure，function and regulation of pyruvate carboxylase [J]. Biochem J，1999，340(pt 1)：1-16.

［20］ Heiden M G V，Choy J S，Vanderweele D J，et al. Bcl-x(L)complements Saccharomyces cerevisiae genes that facilitate the switch from glycolytic to oxidative metabolism[J]. J Biol Chem，2002，277(47)：44870-44876.

［21］ Rajalingam K，Wunder C V，Churin Y，et al. Prohibitin is required for Ras-induced Raf-MEK-ERK activation and epithelial cell migration [J]. Nat Cell Biol，2005，7(8)：837-843.

［22］ Mengwasser J，Piau A P，Sleeman J P. Differential immunization identifies PHB1/PHB2 as blood-borne tumor antigens[J]. Oncogene，2004，23(44)：7430-7435.

［23］ Coates P J，Nenutil R，McGregor A，et al. Mammalian prohibitin proteins respond to mitochondrial stress and decrease during cellular senescence[J]. Exp Cell Res，2001，265(2)：262-273.

［24］ Kolonin M G，Saha P K，Chan L，et al. Reversal of obesity by targeted ablation of adipose tissue [J]. Nat Med，2004，10(6)：625-632.

［25］ LIU D，Lin Y，Kang T，et al. Mitochondrial dysfunction and adipogenic reduction by prohibitin silencing in 3T3-L1 cells[J]. PLoS One，2012，7(3)：e34315.

［26］ Wilson-Fritch L，Burkart A，Bell G，et al. Mitochondrial biogenesis and remodeling during adipogenesis and in response to the insulin sensitizer rosiglitazone[J]. Mol Cell Biol，2003，23(3)：1085-1094.

［27］ Vessal M，Mishra S，Moulik S，et al. Prohibitin attenuates insulin-stimulated glucose and fatty acid oxidation in adipose tissue by inhibition of pyruvate carboxylase[J]. FEBSJ，2006，273(3)：568-576.

［28］ Ikonen E，Fiedler K，Parton R G，et al. Prohibitin，an antiproliferative protein，is localized to mitochondria[J]. FEBS Lett，1995，358(3)：273-277.

［29］ Brasaemle D L，Dolios G，Shapiro L，et al. Proteomic analysis of proteins associated with lipiddroplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1adipocytes[J]. J Biol Chem，2004，279(45)：46835-46842.

Research Progress of the Relationship Between PHB and Carbohydrate Metabolism and Fat Metabolism

FANG Wen，FENG Hong*
(Department of Health and Exercise Science，Tianjin University of Sport，Tianjin 300381，China)

Prohibitin(PHB)is a highly conserved protein in the evolution.It is widely distributed in bacteria，yeast，Drosophila，protozoa and mammals in a variety of biological cells.PHB has diverse functions.Mainly by nuclear genes encoding，it is located in the inner mitochondrial membrane，nucleus，cell membrane and matrix.Because of its special location，mitochondria structure and function，it has attracted widespread interests.In recent years，researches relating to mitochondrial function have gradually become a new hot spot，including the maintenance of mitochondrial morphology and function，the involvement in the regulation of mitochondrial energy metabolism and so on.In this paper，PHB and mitochondria and the important role of its metabolism and fat metabolism in the mitochondrial metabolism were studied and the relationship between PHB and energy metabolism was further explained.

Prohibitin(PHB)；mitochondria；carbohydrate metabolism；fat metabolism

Q51

：A

：1006-8945(2016)05-0030-04

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国家自然科学基金面上项目：Prohibitin 1 在运动能量代谢中的作用及调控F0F1-ATP合酶机制(编号：31470061)。

2016-04-06