手性配体交换毛细管电泳在氨基酸手性分析中的应用研究进展

木肖玉,　齐　莉,　苏　圆,　乔　娟,　陈　义

(1. 中国科学院化学研究所, 中国科学院活体分析化学重点实验室, 北京 100190; 2. 中国科学院大学, 北京 100049; 3. 山东农业大学, 山东 泰安 271018)



手性配体交换毛细管电泳在氨基酸手性分析中的应用研究进展

木肖玉1,2,齐莉1*,苏圆1,3,乔娟1,陈义1

(1. 中国科学院化学研究所, 中国科学院活体分析化学重点实验室, 北京 100190; 2. 中国科学院大学, 北京 100049; 3. 山东农业大学, 山东 泰安 271018)

摘要:氨基酸的手性分析在生命科学中具有重要的研究意义。手性配体交换毛细管电泳法作为常用的氨基酸的手性分析方式之一,具有高效、快速、样品迁移顺序可调等优点,引起了研究者们极大的兴趣。本文主要综述了近年来手性配体交换毛细管电泳法在氨基酸的手性分析中的应用研究进展。

关键词:手性配体交换毛细管电泳;D,L-氨基酸;手性分析;综述

众所周知,手性是自然界的基本属性。一方面,手性问题与生命体的起源、生存和演化有着密切的联系,人们已在星际碎冰样品及坠落于地球表面的碳质球粒陨石(如:默奇森陨石)样品中探索到了数种手性分子,并发现其中的左旋异缬氨酸的含量比右旋异缬氨酸高出18%,这表明来自外太空的手性分子可能参与了地球原始生命的起源[1];另一方面,构成生命体的许多常见的生物分子(如:氨基酸、蛋白质、核苷酸、DNA和糖等)都具有手性结构,虽然这些手性分子的对映异构体在化学及物理特性上大致相同,但两者在生命体内的组成及其所起的作用却存在着极大差别。氨基酸是蛋白质的基本组成单元,且大多数氨基酸都存在D型和L型两种对映异构体,但L-氨基酸与D-氨基酸的生理活性却并不相同,L-氨基酸是人体重要的营养物质,并被广泛地应用于食品、化妆品和医药等领域;而D-氨基酸的浓度变化则与一些重要的生理疾病息息相关(如:阿尔兹海默症、精神分裂症等)[2];组成生物酶的氨基酸中,如用D-氨基酸来取代其中的L-氨基酸,酶的高级结构就会被破坏,就会引起酶活性的降低甚至丧失。由此可见,氨基酸的手性问题不仅仅是一个化学问题,也是一个与药学、医学、生物学、生命科学等研究领域密切相关的关键科学问题。因此,建立高效的氨基酸对映体手性分离分析方法具有重要的研究意义。

目前,常用的针对氨基酸对映体的手性分析方法包括化学法、结晶法、膜法、酶法、比色法、分光光度法、电化学法和色谱法等。其中,色谱手性分析方法可分为高效液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法和毛细管电泳法等。毛细管电泳法是一种新型的手性分析方法,具有高效、快速、自动化、多模式、样品和试剂用量少等优点。近年来,毛细管电泳法被广泛应用于氨基酸对映体的手性分析中。在毛细管电泳手性分析法中,常用的手性选择剂包括:环糊精(cyclodextrin, CD)、蛋白质、大环抗生素、冠醚和金属复合物等。其中,以金属复合物为手性选择剂的毛细管电泳法称为手性配体交换毛细管电泳法(chiral ligand exchange capillary electrophoresis, CLE-CE)。

俄罗斯科学家Davankov等[3]于1971年最先提出构建手性配体交换液相色谱手性分析方法的理念,其原理如图1所示,金属离子和手性配体会形成较稳定的二元复合物,当被分析物(D-手性对映体或L-手性对映体)与手性配体发生配体交换作用时,会形成新的三元金属复合物,新形成的基于D-手性对映体及L-手性对映体的三元金属复合物之间的稳定性会出现差异,因此,它们会按照各自色谱保留行为的不同而依次流过液相色谱的检测窗口,由此而实现了对映体的手性分离。

图2　手性配体交换毛细管区带电泳分离机理示意图Fig. 2　Illustration of chiral ligand exchange capillary zone electrophoresis separation mechanismL-AA: L-amino acid; D-AA: D-amino acid. EOF: electroosmotic flow.

M: central ionSel: selectorA: analyte

图 1手性配体交换机理示意图

Fig. 1Illustration of chiral ligand exchange mechanism

1985年,美国斯坦福大学的Gassmann及Zare等[4]首次将手性配体交换的原理引入到毛细管电泳中,并成功采用CLE-CE分离了氨基酸对映体。随后,不同的研究小组建立了一系列的CLE-CE新体系,并将其应用于氨基酸的手性分离分析研究中,其研究结果充分展示了CLE-CE在氨基酸的手性分析中所具有的重要的应用潜力。本文主要综述了近年来CLE-CE在氨基酸手性分析中的应用研究进展。

1毛细管区带电泳手性分析

1.1手性氨基酸配体

以氨基酸作为配体的CLE-CE体系中,最常用的中心离子为Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)。Gassmann和Zare等[4]于1985年建立了以Cu(Ⅱ)为中心离子,以L-组氨酸为手性配体的CLE-CE体系,并实现了数对丹酰氯衍生的氨基酸的手性分离。随后,人们建立了一系列以Cu(Ⅱ)为中心离子,以氨基酸为手性配体的CLE-CE体系。如:Yuan等[5]以Cu(Ⅱ)-L-精氨酸为手性选择剂,在15 min内实现了6对丹酰氯衍生的D,L-氨基酸的良好分离(手性分离度介于1.1及2.3之间);他们还进一步发现,若以Co(Ⅱ)和Ni(Ⅱ)等过渡金属离子来取代Cu(Ⅱ)作为中心离子,或者将配体取代为L-谷氨酸、L-丙氨酸和L-天冬氨酸时,其手性识别能力会显著下降,甚至会完全丧失其手性分离能力。此研究结果表明:氨基酸的手性识别效率与三元金属复合物的性质密切相关。Lu等[6]构建了以Cu(Ⅱ)-L-赖氨酸为手性选择剂的CLE-CE体系,并实现了4对非衍生氨基酸的高效手性分离。Lecnik等[7]发展了基于Cu(Ⅱ)-L-脯氨酸的CLE-CE体系并用于分离非衍生氨基酸对映体,并发现此体系的手性分析效率较低。Zheng等[8]建立了基于Cu(Ⅱ)-L-缬氨酸手性选择剂的CLE-CE体系,同时实现了11对丹酰氯衍生氨基酸对映体和2对非衍生氨基酸对映体的良好手性分离;后来,他们[9]还发展了基于Cu(Ⅱ)-L-鸟氨酸复合物的CLE-CE体系,实现了丹酰氯衍生氨基酸对映体的高效分离。Zhao等[10]采用Cu(Ⅱ)-L-谷氨酸作为手性选择剂,开展了3对非衍生氨基酸对映体(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)的CLE-CE手性分析研究。Mohr等[11]构建了以L-苯丙酰胺、L-赖氨酸和L-苏氨酸为配体的CLE-CE体系,同时还考察了不同中心金属离子(包括Cu(Ⅱ)、Co(Ⅱ)和Ni(Ⅱ)等)对氨基酸对映体手性分离效率的影响,发现:采用Cu(Ⅱ)-L-赖氨酸体系能获得最佳的手性分离效果,其中,丹酰氯衍生的D,L-甲硫氨酸的手性分离度高达17.0。除上述各研究小组所发展的以Cu(Ⅱ)为中心离子的CLE-CE体系以外,我们实验室还发展了一系列以Zn(Ⅱ)为中心离子,以不同的氨基酸为配体的CLE-CE新体系,实现了3对未衍生芳香族氨基酸对映体的基线分离及4对芴基甲酯衍生的脂肪族氨基酸对映体的部分分离[12];之后,我们优化了基于Zn(Ⅱ)-L-赖氨酸复合物的CLE-CE分离体系,发现芳香族氨基酸对映体的手性分离度可达7.09[13],还发现:当采用D-赖氨酸作为配体时,氨基酸手性对映体的迁移顺序发生了变化,这表明中心离子与手性配体所形成的三元金属复合物的结构是影响被分析物迁移顺序的关键因素;我们进一步构建了基于Zn(Ⅱ)-L-鸟氨酸手性选择剂的CLE-CE体系,实现了3对非衍生芳香族氨基酸对映体和4对丹酰氯衍生氨基酸对映体的基线分离[14]。

在毛细管区带电泳体系中,若仅采用单一手性选择剂,有时并不能获得令人满意的手性分离效果,研究者们发现:当在所建立的体系中再引入另外一个手性选择剂来构成双手性选择剂体系时,其手性分离效率将会得到明显地改善。众所周知,CD是一类毛细管区带电泳中最常用的手性选择剂,为了提高分析物的手性分离效率,人们尝试着将其引入CLE-CE体系中。Zheng等[15]发展了以Mn(Ⅱ)-L-丙氨酸和β-CD作为双手性选择剂的CLE-CE体系,并实现了3对丹酰氯衍生的氨基酸对映体的有效分离。我们实验室亦发现:将β-CD引入Zn(Ⅱ)-L-缬氨酸体系中时,确实能明显改善CLE-CE的手性分析效率;进一步采用此双手性选择剂体系,实现了3对非衍生氨基酸对映体和12对丹酰氯衍生的氨基酸对映体的良好手性分离[16]。随后,我们又分别建立了以β-CD作为手性添加剂的Zn(Ⅱ)-L-丙氨酸和Zn(Ⅱ)-L-亮氨酸CLE-CE体系,利用β-CD的手性分离协同作用,实现了丹酰氯衍生的氨基酸对映体的高效分离[17,18]。上述研究结果表明:在CLE-CE体系中引入其他种类的手性选择剂时,第二手性选择剂所起的手性分离协同作用的确有利于提高CLE-CE体系的手性分离效率。

1.2手性氨基酰胺配体

Chen等[19]于2002年发展了以Cu(Ⅱ)-L-氨基酰胺(包括L-苯丙酰胺、L-脯氨酰胺和L-丙氨酰胺)为手性选择剂的CLE-CE体系,并发现:以不同的氨基酰胺为手性配体时,其对丹酰氯衍生氨基酸对映体的手性识别效率和对映体的迁移顺序是不同的,当以Cu(Ⅱ)-L-苯丙酰胺和Cu(Ⅱ)-L-丙氨酰胺作为手性选择剂时,L-对映体的迁移速度比D-对映体快,而当以Cu(Ⅱ)-L-脯氨酰胺为手性选择剂时,D-对映体的迁移速度更快;他们还对比了以Cu(Ⅱ)-L-氨基酰胺作为手性选择剂时,氨基酸对映体在不同体系(包括毛细管电泳体系、毛细管电色谱体系和微柱液相色谱体系)中的手性分离效率和迁移顺序[20],结果发现:在毛细管电色谱体系和微柱液相色谱体系中,D-对映体的迁移速度比L-对映体快,但例外的是,在毛细管电色谱体系中,丹酰氯衍生的L-丝氨酸的迁移速度更快。基于此现象,Chen等[21]对不同体系的手性识别机理和对映体迁移顺序差异的机理进行了探讨,还采用紫外光谱研究了不同pH条件下,Cu(Ⅱ)-L-脯氨酰胺复合物的存在形式和种类,他们发现:随着电泳缓冲液pH的增加,Cu(Ⅱ)-L-脯氨酰胺复合物的最大紫外吸收波长逐渐向短波长移动,表明在不同pH的缓冲溶液中,Cu(Ⅱ)-L-脯氨酰胺复合物有不同的存在形式,继而产生了不同的手性分离效果。我们实验室近年构建了以Zn(Ⅱ)为中心离子,以L-氨基酰胺为手性配体的CLE-CE体系,实现了丹酰氯衍生氨基酸对映体的高效分离[22,23],并发现:以不同的氨基酰胺作为手性配体的CLE-CE体系具有不同的手性分析效果和不同的对映体迁移顺序,当以L-丙氨酰胺为手性配体时,D-氨基酸迁移速度较快[22],而以L-脯氨酰胺为手性配体时,L-氨基酸迁移速度更快[23],我们的研究结果与文献[19]所报道的现象相反,这可能是由于中心离子不同,所形成的三元金属复合物结构不同,因而导致所构建的CLE-CE体系的手性识别能力和氨基酸对映体的迁移顺序不同。

1.3手性氨基酸离子液体配体

1.4其他手性配体

除了氨基酸、氨基酰胺和氨基酸离子液体以外,还有一些氨基酸衍生物和糖类也被人们作为CLE-CE体系中的手性配体而应用于氨基酸对映体的手性分析研究中。如:Végvári等[34]以N-2-羟辛基-L-4-羟基脯氨酸作为手性配体,以Cu(Ⅱ)作为中心离子构建了CLE-CE体系,并实现了对非衍生氨基酸对映体的有效手性分离。Schmid等[35]发展了以L-4-羟基脯氨酸衍生物(包括L-4-羟基脯氨酸、N-2-羟丙基-L-4-羟基脯氨酸和N-2-羟辛基-L-4-羟基脯氨酸)作为手性配体的CLE-CE体系,并对比了不同体系对氨基酸对映体和二肽对映体的手性分离效率的差异。我们实验室建立了以Zn(Ⅱ)为中心离子,以L-羟基脯氨酸为手性配体的CLE-CE体系,发现其对氨基酸对映体和二肽对映体的手性分离效果不够理想,因而引入了γ-CD作为第二手性选择剂,利用γ-CD的协同手性分离作用,显著提高了氨基酸对映体和二肽对映体的手性分离效率[36]。我们还依据密度泛函理论,采用计算模拟法对CLE-CE体系中金属配合物的稳定性进行了研究,并对环糊精和L-羟脯氨酸金属配合物的协同作用机理进行了初步探讨。Gozel等[37]以Cu(Ⅱ)-L-阿斯巴甜复合物作为手性选择剂,在12 min内实现了14对丹酰氯衍生氨基酸对映体的基线分离,他们发现:与Cu(Ⅱ)-L-组氨酸体系相比,基于Cu(Ⅱ)-L-阿斯巴甜复合物的CLE-CE体系能明显改善氨基酸对映体的手性分离效率。Hödl等[38]将3种不同的糖酸作为手性配体,对比了不同中心离子的CLE-CE体系对氨基酸对映体和二肽对映体的手性分离分析效率的影响。

2胶束电动毛细管电泳手性分析

在进行氨基酸对映体混合样品的手性分离分析时,研究者们发现:在电泳缓冲液中加入表面活性剂能明显改善氨基酸混合样品的手性分离效率,同时,还会对氨基酸对映体的迁移顺序产生一定的影响。如:Sundin等[39]合成了N,N-二癸基-D-丙氨酸,以其作为手性配体,以Cu(Ⅱ)作为中心离子,开展了丹酰氯衍生氨基酸对映体混合物的手性分离分析研究,为了改善Cu(Ⅱ)-N,N-二癸基-D-丙氨酸复合物的溶解性,他们在电泳缓冲液中加入了十二烷基硫酸钠,采用胶束电动毛细管电泳分离模式进行了氨基酸对映体混合物的CLE-CE手性分析研究。Chen等[40]采用以Cu(Ⅱ)-L-羟基脯氨酸作为手性选择剂的胶束电动毛细管电泳分离模式分析了氨基酸对映体混合物,发现:阴离子型表面活性剂(包括十二烷基硫酸钠、癸基硫酸钠、十四烷基硫酸钠等)不仅可以改善氨基酸对映体的分离效率,还可以改变氨基酸对映体的迁移顺序;他们还发现:在所建立的CLE-CE体系中添加非离子表面活性剂(聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸)时,虽然能改善氨基酸对映体的手性分离效率,但样品的迁移时间会明显增长;而在电泳缓冲液中加入阳离子表面活性剂(溴化十六烷基三甲铵)时,虽然可改变电渗流的方向,但并不能提高氨基酸对映体的手性分离效率。他们继续研究了两类不同的阴离子型表面活性剂,即线型烷基苯磺酸盐(LAS-C8、LAS-C10和LAS-C12)和直链烷基硫酸盐(癸基硫酸钠、十二烷基硫酸钠和十四烷基硫酸钠)，对氨基酸对映体的CLE-CE手性分离效率的影响[41],还研究了以不同构型的氨基酸(如:D-脯氨酸、L-脯氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸)作为CLE-CE体系的手性配体时,电泳缓冲液中所加入的十二烷基硫酸钠对氨基酸对映体迁移顺序和手性分离效率的影响[42]。Chen等[21]研究发现:在以Cu(Ⅱ)-L-脯氨酰胺为手性选择剂的CLE-CE体系中加入十二烷基硫酸钠,不会引起氨基酸对映体的迁移顺序的改变,但会显著改善其手性分离效率。Lu等[6]将十二烷基硫酸钠作为添加剂应用于以Cu(Ⅱ)-L-赖氨酸复合物为手性选择剂的CLE-CE体系中,实现了对混合氨基酸样品的良好手性分离;同时,他们还发现:加入十二烷基硫酸钠后,氨基酸对映体的迁移顺序发生了改变,在毛细管区带电泳分离模式中D-氨基酸对映体的迁移速度更快,但在胶束电动毛细管电泳分离模式中L-氨基酸对映体的迁移速度更快。Zheng等[8,43]构建了以Cu(Ⅱ)-L-缬氨酸复合物及Cu(Ⅱ)-D-缬氨酸复合物为手性选择剂的CLE-CE体系,以十二烷基硫酸钠为添加剂,采用胶束电动毛细管电泳分离模式,分别实现了未衍生氨基酸对映体和丹酰氯衍生的氨基酸对映体的混合样品的良好手性分离。手性配体交换胶束电动毛细管电泳分离机理示意图见图3。

图3　手性配体交换胶束电动毛细管电泳分离机理示意图Fig. 3　Illustration of chiral ligand exchange micellar electrokinetic chromatography separation mechanismSDS: sodium dodecyl sulfate.

3毛细管电色谱手性分析

毛细管电色谱法是结合了高效液相色谱和高效毛细管电泳二者优点的新型分离方法。近年来,研究者们也尝试将手性配体交换和毛细管电色谱结合进行氨基酸的手性分离分析研究。如:Schmid等[44]于2000年以甲基丙烯酸为单体,以对二氮己环丙烯酰胺为交联剂,以乙烯基磺酸为产生电渗流的物质,以N-(2-羟基-3-烯丙氧基)-L-4-羟基脯氨酸为手性选择剂,以过硫酸铵和四甲基乙二胺为引发剂,在毛细管内原位聚合制备了具有良好手性选择性的手性固定相,采用CLE-CE实现了9对氨基酸对映体的良好分离。Chen等[45]使用溶胶-凝胶法制备了具有良好机械强度和渗透性的硅胶基质整体柱,在其表面化学键合L-苯丙酰胺,得到了手性硅胶整体柱,并成功地将其应用于丹酰氯衍生的氨基酸对映体的CLE-CE手性分离分析研究中。Nishiyama等[46]制备了L-赖氨酰胺修饰的手性硅胶整体柱,采用毛细管电色谱法和微柱高效液相色谱法,开展了丹酰氯衍生的氨基酸对映体的CLE-CE手性分离分析研究,并对比了其分离结果。Pittler等[47]制备了两种硅胶基质手性固定相,一种是L-4-羟基脯氨酸化学修饰的手性固定相,一种是N-癸基L-4-羟基脯氨酸动态涂覆在毛细管壁的手性固定相,他们发现:化学键合的手性固定相在氨基酸对映体和二肽对映体的手性分离中效果更好,而动态涂覆的手性固定相在羟基酸对映体的CLE-CE手性分离中显示出了其独特的优势。

手性配体交换毛细管电色谱分离机理示意图见图4。

图4　手性配体交换毛细管电色谱分离机理示意图Fig. 4　Illustration of ligand exchange capillary electrochromatography separation mechanism on the chiral stationary phase

4应用

CLE-CE具有高效、快速、样品用量少和对映体迁移顺序可调等优点,在氨基酸对映体的手性分离中显示出其独特的优势。由于手性氨基酸具有重要的生理意义,而且它们在体内的代谢与氨基酸酶(如D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶、氨基酸消旋酶、L-天冬酰胺酶等)密不可分,且与白血病、帕金森病及精神分裂症等疾病具有重要的联系,因此,开展基于CLE-CE的氨基酸手性分析研究、氨基酸酶的酶动力学研究及氨基酸酶的酶抑制剂筛选研究在生命分析领域具有重要的研究意义和深远的应用前景。

我们实验室建立了以Zn(Ⅱ)-L-鸟氨酸复合物为手性选择剂的CLE-CE体系,以D-色氨酸作为D-氨基酸氧化酶的底物,将所发展的CLE-CE方法率先用于D-氨基酸氧化酶的酶反应动力学研究中[14]。近年来,我们还将本实验室所构建的一系列高效CLE-CE新体系应用于L-氨基酸氧化酶[16,32]、L-酪氨酸氧化酶[17,18]、L-天冬酰胺酶[29]的酶反应动力学研究及酶的抑制剂筛选[17,18,23,28,30,48]研究中;不仅开展了氨基酸对映体及二肽的纯度分析[36],而且还将所构建的CLE-CE体系用于活体鼠肾缺血模型中D-氨基酸氧化酶的酶活性分析研究[22];并进一步采用CLE-CE方法对所制备的新型酶反应器进行了酶性能的评价研究,探索了固定化L-天冬酰胺酶在急性淋巴细胞白血病治疗中的潜在应用价值[29]。

5总结与展望

CLE-CE自1985年首次由美国科学家Gassmann及Zare提出以来,已引起了人们越来越浓厚的研究兴趣。近年来,虽然研究者们已通过开发不同的中心离子和手性配体,建立了一系列高效的CLE-CE新体系,并应用于氨基酸、羟基酸和小肽等对映体的手性分离分析及氨基酸酶的酶反应研究中,但迄今为止,CLE-CE的研究依然面临着一些困难和挑战,如:目前中心离子(主要局限于Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)及Mn(Ⅱ)等)和手性配体(主要局限于氨基酸、氨基酸衍生物、氨基酰胺、氨基酸离子液体等)的种类有限,分析对象(一般为具有羟基、氨基和羧基等基团的化合物)的范围较窄,CLE-CE机理研究和基于CLE-CE的生物样品的分析应用仍然较少等。而这些难题的解决将会极大地推进CLE-CE方法和毛细管电泳技术的发展,因此,研究者们在未来尚需开发更多的新配体,构建更新颖的CLE-CE体系,深入研究其机理,并需进一步拓展其应用范围。合成制备多种金属配位能力强且易于发生配体交换作用的新型手性配体应是未来人们解决这些疑难问题的关键,开拓多元手性选择剂亦是提高CLE-CE手性分离效率的途径之一,而引入更多的热力学理论计算模型并通过分析手性分离过程中的热、熵、焓等多种参数的变化是未来人们深入开展CLE-CE机理研究的有效通道;研究者们今后还应将所建立的高效CLE-CE体系进一步用于药物分析、手性新药开发、酶型药物评价、疾病诊疗及活体分析等领域,以推进CLE-CE方法和毛细管电泳技术的快速深入发展。

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Development of chiral ligand exchange capillary electrophoresis for enantioseparation of D,L-amino acids

MU Xiaoyu1,2, QI Li1*, SU Yuan1,3, QIAO Juan1, CHEN Yi1

(1. Key Laboratory of Analytical Chemistry for Living Biosystems, Institute of Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;3. Shandong Agricultural University, Taian 271018, China)

Abstract:Enantioseparation of D,L-amino acids is of great significance in life science. As one of the most useful methods, chiral ligand exchange capillary electrophoresis possesses many advantages, including high efficiency, fast speed and tunable migration order, and it has attracted great research interest. This review summarizes the development of chiral ligand exchange capillary electrophoresis for enantioseparation of D,L-amino acids in recent years.

Key words:chiral ligand exchange capillary electrophoresis (CLE-CE); D,L-amino acids; enantioseparation; review

DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.05038

*收稿日期:2015-05-28

基金项目:国家自然科学基金项目(21175138,21321003).

中图分类号:O658

文献标识码:A

文章编号:1000-8713(2016)01-0021-07

色谱手性分离专刊·专论与综述

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Foundation item: Project of the National Natural Science Foundation of China (Nos. 21175138, 21321003).