不同浓度PVP对微胶囊化保存猪精子质量的影响

赵　康，孙天宇，马志远，王国鑫，张海涛，尹国安，李井春

(黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆 163319)



不同浓度PVP对微胶囊化保存猪精子质量的影响

赵康，孙天宇，马志远，王国鑫，张海涛，尹国安，李井春

(黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆 163319)

摘要：实验主旨为探讨聚乙烯吡咯烷酮(PVP)浓度与猪精子微胶囊质量的关系。使用含有不同浓度的PVP(0.1%，0.4%，0.8%)的猪精液稀释液稀释猪精液并制作微胶囊，使用全自动精子质量分析仪检测在37℃条件下不同保存时间的精子质量参数。在37℃条件下，0.4% PVP组与对照组、0.1% PVP和0.8% PVP组间相比精子活力要显著高(P<0.05)；0.4% PVP组的精子直线速度也优于其他各组；0.4% PVP组精子畸形率要比对照组、0.1% PVP组和0.8%组的要低(P<0.05)；在24 h内对照组的精子释放数最高，0.4% PVP组次之，0.8% PVP组最少。以上结果证实添加0.4% PVP在一定程度上能改善微胶囊化保存猪精子的质量和微胶囊的缓释率，为实现猪单次人工授精而受孕提供实验数据及理论支持。

关键词：猪；精子；微胶囊；PVP；精子质量

猪精子微胶囊化保存是一种新兴的生物技术，由Faustini 等人的研究可知微胶囊是一种可以形成免疫隔离屏障的半透膜结构，具有良好的生物相容性，能阻遏免疫细胞以及引起免疫排斥反应的大分子抗体，同时允许氧气、营养物质和一些具有生物活性的小分子物质自由出入[1]。由Lim Fu等人的研究可知微胶囊可以维持适宜浓度的精子存活一段较长的时间后仍具有受精的能力[2]。这就使把精子保存在微胶囊内用来人工授精成为可能，因为每单位时间都有精子从微胶囊内释放从而与卵子的排放时间相协调，理论上可以提高受精率。

聚乙烯吡咯烷酮(Pholyvinyl Pyrrolidone，PVP)是一种水溶性高分子化合物，具有成膜性、生物相容性、高分子表面活性等性能。据Yutaka 等人在2000年的研究表明PVP用于猪精子的稀释液中可延缓精子的运动速度，减小精子的动能损失从而延长精子的保存时间[3]。由Dozortsev在1995年的研究可知PVP用在精子稀释液中可以形成保护膜能减少外界环境对精子造成的损害。可以使Ca2+波动出现的时间延迟，从而阻碍精子提前获能达到保存精子的目的[4]。这为PVP用于提高微胶囊化猪精子的保存提供理论依据。

由于制作精子微胶囊采用的材料和方法不同，所获得微胶囊的质量也有差异。优化精子微囊制备条件，可以减少制作微胶囊时对精子的伤害，提高精子在体外及体内的保存时间，从而提高受胎率。本实验检测精液稀释液中添加不同浓度PVP对胶囊化保存猪精子质量及微胶囊缓释率的影响。

1材料与方法

1.1实验材料与药品

猪精液(购自大庆市春雷牧场，2～4岁长白种公猪)、海藻酸钠(Sigma,USA,Lot No.SLBM3663V)、氯化钡(Lot# 20150913)、PVP(Sigma,USA,Lot No.BCBD3211V)、葡萄糖等。

精子稀释液:80%(葡萄糖60g/L+HEPES 2.383g/L+NaHCO31.2g/L+青霉素0.0725g/L+链霉素0.05g/L)+20%卵黄液，0.1%PVP(精子稀释液99.9%+PVP0.1%)，0.4%PVP(精子稀释液99.6%+PVP0.4%)，0.8%PVP(精子稀释液99.2%+PVP0.8%)，对照组:0.0%PVP(精子稀释液100%)

精子释放液:葡萄糖25.0423g/L+NaHCO32.1061g/L+NaCl 6.5426g/L+KCl 0.2015g/L+NaH2PO4·2H2O 0.04799g/L+Nalactate 1.868g/L+MgCl2·6H2O 0.1016g/L+HEPES 1.1915g/L+BSA6 mg/mL

1.2实验方法

1.2.1猪精液的采集与制备

从健康的长白猪种公猪采集新鲜的原精，用精子分析仪评估精子的活力、直线速度、畸形率等指标，其中精子活率至少90%才可用于胶囊的制作。用0.1%PVP，0.4%PVP，0.8%PVP和0.0%PVP(对照组)把精子的浓度稀释为1×108sperm/mL，保存在17℃恒温箱内，待制微胶囊。

1.2.2猪精子微胶囊的制作

把饱和氯化钡溶液(保存在25℃室温内)分别加入到用4种不同浓度PVP稀释后的精液中，使Ba2+离子终浓度达到25mmol/L；得到的悬浊液轻轻摇匀，通过蠕动泵让其以60滴/min的速度通过25mm口径的透明软管(软管口距离液面120mm)，滴入0.5%(w/v)海藻酸钠溶液中；当其接触到液面时Ba2+从精液滴中扩散与海藻酸钠溶液相互作用，形成钡-海藻酸钠膜包裹的精液滴[5]；待微胶囊反应20min，收集过滤微胶囊，用生理盐水洗涤3次，备用。

1.2.3精子质量评价

把制作好的猪精子微胶囊放置在稀释液的培养皿中，保存在37℃培养箱内，在不同的保存时间段内用迈朗全自动精子分析仪(CASA)进行微胶囊化猪精子质量检测(主要评估精子的活力、直线速度、畸形率等)。

1.2.4微胶囊精子释放率的检测

把制作好的猪精子微胶囊装在含有精子释放液的离心管中并保存在37℃培养箱内(模拟自然状态下精子在母猪体内的生存环境)，在设定的时间梯度内，用生物显微镜计算精子从微胶囊中释放的数目。

1.3数据统计分析

利用StatView5.0统计软件对实验测定的各项数据指标进行方差分析和多重比较，实验结果以平均数±标准差来表示，P<0.05表示差异显著。

2结果

2.137℃条件下，不同浓度PVP对微胶囊化保存的猪精子质量的影响

2.1.1不同浓度PVP对微胶囊化保存猪精子活力的影响

由表1可知，在37℃保存下，随着时间的延长，微胶囊化猪精子活力呈下降趋势。在1 h时，对照组与0.1% PVP组间差异显著(P<0.05)，其中对照组的活力最好，0.8% PVP组次之，0.1% PVP组最差。从保存6～12h，0.4%PVP组精子活力显著高于其他组，在一定程度上提高精子在保存过程中的精子活力，0.4%PVP组的精子随着保存时间的延长，精子活力下降的速度相对缓慢。

表1　不同浓度的PVP对微胶囊化保存精子活力的影响(%)

注：对照组没有添加PVP，同列数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.1.2不同浓度PVP对微胶囊化保存猪精子直线速度的影响

由表2可知，在37℃保存下，随着时间的延长，微胶囊化的猪精子直线速度呈下降趋势。在30 min时，各组之间差异不显著(P>0.05)；在1h 时，对照组和0.4%PVP组显著高于0.1%和0.8PVP组；在保存3h时，对照组、0.4%PVP组与0.8%PVP组间差异显著(P<0.05)；在6h时，0.8%PVP组与其他三组间差异显著(P<0.05)，且其直线速度最低；在12h时，所有组中，0.4% PVP的精子直线速度最高；在24h时，对照组和0.4%PVP组的直线速度明显高于0.8%PVP组，综合以上结果来看，精液中0.4% PVP在一定程度上减缓精子直线速度的降低。

表2　不同浓度的PVP对微胶囊化保存精子直线速度的影响(μm/s)

注：对照组没有添加PVP，同列数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.1.3不同浓度PVP对微胶囊化保存猪精子畸形率的影响

由表3可知，精子随着保存时间的延长微胶囊化猪精子畸形率呈上升趋势。在30 min，1 h时，各组间精子的畸形率差异不显著(P>0.05)；在3 h、6 h时，对照组、0.1%PVP、0.4% PVP组与0.8%PVP组之间差异显著(P<0.05)，其中对照组的精子畸形率最高，0.8%PVP最畸形率最低；在12 h时，0.4% PVP组的畸形率最低；在24h时，对照组的精子畸形率最高，0.4% PVP组的最低。

表3　不同浓度的PVP对微胶囊化保存精子畸形率的影响(%)

注：对照组没有添加PVP，同列数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.237℃条件下，不同浓度PVP对微胶囊化保存猪精子的精子释放率的影响

由表4可知，在37℃保存下，随着保存时间的延长，精子的释放数不断增加。在保存2 h、4 h时，添加不同浓度PVP的微胶囊的精子释放数差异不显著(P>0.05)；在6 h时，对照组与0.8% PVP组间差异显著(P<0.05)，0.8%PVP组的精子释放率最低；在24 h时对照组的精子释放率最高，0.4% PVP组次之，0.8% PVP组最少。从实验结果来看，添加PVP在一定程度上减缓精子从微胶囊释放的速度，为精子微胶囊在雌性生殖道保存精子，延缓精子的释放速度，使生殖道内保持有一定活力精子数量，更有利于提高受胎率，但添加添加0.8%PVP大大减低了精子的释放数量，可能会影响微胶囊的精子释放。

表4　不同浓度的PVP对精子微胶囊释放精子数量的影响(×104sperm/600μL)

注：对照组没有添加PVP，同列数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)。

3讨论

3.137℃条件下，不同浓度PVP对微胶囊化保存的猪精子质量的影响

在本次试验中，综合比较37℃保存条件下，添加0.4%PVP对精子质量的改善效果较好。这与陈东峰[6]等人的研究报道相似。PVP是一种大分子非活性聚合物，添加在精子稀释液中可以使稀释液变得黏稠，所以添加PVP组的精子直线速度要差于对照组。一般认为精子的运动速度越小精子的能量损失越小，故添加PVP能延长精子的保存时间。由陈静[7]的实验结果可知，PVP作为稀释液中的悬浮剂，可使保存过程中猪精子沉降堆积减慢，减少精子相互堆积时产生的代谢产物在局部过度积累。所以添加PVP后精子的活力与畸形率都有不同程度的改善。但由Zhong研究结果可知，PVP有可能参与了微胶囊膜的形成[8]。这就可能使微胶囊内的PVP浓度下降，进而对精子的保存质量效果不稳定。

3.237℃条件下，不同浓度PVP对微胶囊化保存猪精子的精子释放率的影响

本实验中，不同PVP浓度组与对照组间的精子释放率只在6h时有差异，其他时间差异不显著(P>0.05)。由Vigo等人在2009年的实验可知，微胶囊化猪精子的释放率与钡-海藻酸钠膜的通透性有关[9]。本次实验中添加了PVP，由龙宇升等人的实验可知，PVP是一种高分子聚合物，只需较低浓度就可大大增加溶液的黏度[10]。这将导致精子消耗大量的能量才能穿透钡-海藻酸钠膜，并且由于PVP具有成膜性这可能也会阻碍精子的通过，故只有很少部分的精子能从微胶囊中被释放出且精子的释放时间也将延后。

4结论

本试验添加0.4%PVP在一定程度上可以改善微胶囊化保存的猪精子质量，为猪精子微胶囊在单次人工授精上的应用提供理论参考。

参考文献:

[1] M Faustini, M Bucco, G Galeati. Boar sperm encapsulation reduces in vitro polyspermy[J]. Reprod Dom Anim, 2010, 45: 359-362.

[2] Lim Fu, Sun Am. Microencapsulated as bioartificial endocrinepancreas[J]. Science, 1999, 21: 98-99.

[3] Yutaka,Fukui. Technical improvement in Intracytoplasmic sperm injection(ICSI) in cattle[J]. Journal of Reproducfion and Development 2000, 46 : 403-407.

[4] Dozortsev D, Rybouchkin A, De Sutter P.Dhont M.Sperm plasma membrane damage prior to intracy to plasmic sperm injection:anecessory condition for sperm nuclear decondensation[J]. Hum Reprod, 1995, 11: 2960- 2964.

[5] 陈国, 黄世丰. 制备中空海藻酸钙胶囊新方法的研究[J]. 山西大学学报, 2008, 31: 119-123.

[6] 陈东峰, 李伟风, 赵海峰. 聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇对公猪精液常温保存的影响[J]. 养猪, 2012, 04: 41-42.

[7] 陈静. 操作液中不同添加物对猪ICSI的影响[D]. 重庆：西南大学, 2007:111-134.

[8] Yuan zhen Zhong .Hydrogel Prepared from Crosslinked Vinyl Pyrrolidone and Vinyl Acet at Copolymers , Polymer Preprints , 1997 , 38: 578-579 .

[9] Vigo, M Faustini, S Villani. Semen controlled-release capsules allow a single artificial [J]. Theriogenology, 2009, 72: 439-444.

[10] 龙宇升, 康正. 聚乙烯吡咯烷酮的性质及测定[J]. 广州化工, 1999, 27: 33-35.

收稿日期:2016-04-05

作者简介：赵康 (1994-)，男，安徽人，动物科学专业。

基金项目：黑龙江省大学生创新创业训练计划项目(项目名称：猪精子微胶囊的制备及应用研究)；黑龙江八一农垦大学博士启动基金(B2012-07)。

通讯作者：李井春(1979-)，吉林长春人，讲师，博士，研究方向：动物繁殖生物技术。

中图分类号：S828.2

文献标识码：A

文章编号：2095-9737(2016)06-0001-02