利用臭氧诱变果酒酵母营养缺陷型突变株选育研究

梁贵秋，陆春霞，吴婧婧，董桂清，周晓玲，黄正勇，沈蔚

（广西壮族自治区蚕业技术推广总站，南宁市 530007）

利用臭氧诱变果酒酵母营养缺陷型突变株选育研究

梁贵秋，陆春霞，吴婧婧，董桂清，周晓玲，黄正勇，沈蔚

（广西壮族自治区蚕业技术推广总站，南宁市 530007）

利用普通酒精酵母通过臭氧发生器产生臭氧诱变，诱变参数：臭氧浓度为15 mg/m3，时间为10 min；分离、纯培养后筛选出一株的突变株YSS-03。此菌株最大特点是只能利用单糖为碳源发酵产酒精，且酒精耐性15%以上，是一株具有发酵制备功能酒前景的菌株。

臭氧；营养缺陷型；诱变；单糖；果酒酵母

生产果酒的方法主要是利用普通果酒酵母发酵果汁来酿造，发酵前在果汁中添加葡萄糖、蔗糖、蜂蜜等作为酵母产酒碳源[1]。为了使果酒获得功能性或较好的口感，特别是益生果酒类在酿造时都会选择添加低聚糖类，如低聚果糖，低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、蜂蜜等产品，但目前市场上这类产品中含有20%～45%葡萄糖等[2]，这些葡萄糖影响了产品的功能，甚至限制了产品使用人群，使得糖尿病患者对这类产品敬而远之。如果在发酵前添加益生元等低聚糖类原料，虽然解决了产酒碳源问题，但是由于普通果酒酵母对碳源没有专一性，在利用益生元低聚糖中葡萄糖的同时，也把益生元低聚糖类水解成单糖并利用，不但产品功能性没有得到体现，反而造成产品中残糖量过高，影响产品的品质。为了充分利用益生元低聚糖中的葡萄糖做碳源酿造产酒，同时完好保持益生元成分，本研究通过从果酒酵母原始菌株开始，利用臭氧诱变方法，获得营养缺陷型突变菌株YSS-03，此突变株只能利用单糖为碳源发酵产酒且酒精耐受15%以上。通过YSS-03突变株发酵添加有益生元低聚糖的桑果汁制备桑果酒，发酵结果是益生元低聚糖中的单糖（主要是葡萄糖）几乎全部被利用，而益生元低聚果糖成分保存率很高，发酵液中的酒精含量超过13%，获得很好市场前景的功能性桑果发酵酒。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 果酒酵母（安琪葡萄酒活性干酵母，内部编号：YSS-01），通过市场采购、活化、分离筛选得原始菌种。

1.1.2 主要实验试剂 蔗糖（国药集团，AR）；Na2HPO4（广东汕头市西陇化工厂，AR）；NaH2PO4（广东汕头市西陇化工厂，AR）；100%乙腈（广东汕头市西陇化工厂，色谱纯）；超纯水（自制）；无水葡萄糖（天津市大茂化学仪器供应站，AR）；低聚果糖（市场采购，55型食品配料级，南宁纵联科技有限公司）。

1.1.3 实验仪器 电子分析天平（梅特勒，AL-2004），精密数显酸度计（上海电子仪器厂，PHS-25），HH-4电子恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司），台式离心机（上海安亭科学仪器厂制造，ANKE-TGL-16G），高效液相色谱仪（日本岛津公司，（LC-10A），色谱工作站 浙大N200），生化培养箱（SPX-160，常州），臭氧发生器（LT-D928，LITIAN/力天），臭氧浓度试纸（0～40 mg/m3，杭州陆恒生物科技有限公司），酒精计（DMA35，Anton Paar）。

1.2 方法

1.2.1 培养基及培养条件

1.2.1.1 斜面培养基 葡萄糖25 g，蛋白胨12 g，酵母浸出粉12 g，硫酸镁1.0 g，硝酸钠1.5 g，KH2PO40.2 g，用蒸馏水溶解后定容到1 000 mL，琼脂4.0 g/L，pH值为6.8～7.2，121℃，0.1 Mpa，灭菌30 min。接种酵母后置于28℃，培养30 h。

1.2.1.2 分离培养基 蔗糖20g，蛋白胨15 g，酵母浸出粉10 g，硫酸镁1.0 g，硝酸钠2.0 g，KH2PO40.2 g，用蒸馏水溶解后定容到1 000 mL，琼脂4.0 g/L，于121℃，0.1 Mpa，灭菌30 min。接种酵母后生化培养箱30℃，培养48 h。

1.2.1.3 摇瓶培养基 葡萄糖35 g玉米浆粉15 g，豆饼粉20 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，KH2PO30.5 g，于121℃，0.1 Mpa，灭菌60 min，pH值为6.8～7.0，温度为30℃，接种酵母后培养20～28 h.。

1.2.1.4 100 L扩大培养基 葡萄糖35 g，玉米浆粉15 g，豆饼粉25 g，MgSO4·7H2O 1.2 g，KH2PO30.5 g，于121℃，0.1 Mpa，灭菌60 min。pH值为6.5～7.5，接种酵母后温度为30℃，发酵20 h。

1.2.1.5 发酵桑果汁产酒（W%） 桑果汁用55型低聚果糖浆调固形物至250BX，瞬时灭菌温度为120～135℃，5～8 s，降温至28～30℃，接突变株酵母0.5%发酵144～196 h。

1.2.2 臭氧诱变

1.2.2.1 诱变原理[3]臭氧分子直接氧化细胞的遗传物质和分解RNA、DNA、蛋白质、脂类、多糖分子等，破坏细胞内各酶类系统，导致酵母的生长代谢受到破坏甚至细胞失活。臭氧分子与有机生物体发生各类复杂生化反应，对蛋白质、氨基酸、核酸等有机生物分子有较强的氧化反应，将细胞代谢所产生的酸类物质，瞬间氧化去羧基基团，导致细胞内溶物局部pH值升高，臭氧还具有较高的细胞因子表达特异性能。

1.2.2.2 诱变方法[4]培养30 h的斜面种置于密闭且臭氧灭菌25 min，放置3～5 h后的臭氧发生器仓内，使菌株暴露于臭氧仓内。启动臭氧发生器，使臭氧不断产生，待臭氧浓度升到一定值后，停止臭氧发生器，菌株在臭氧仓内放置0～10 min，取出加入浓度为19.6 g/L磷酸缓冲液，重复冲洗多次，洗后缓冲液倒到灭菌好的三角瓶中盖好，吸取1 mL菌液于100 mL的斜面培养基中，在28～30℃，生化培养箱培养10～12 h，马上转到5～10℃保存10 h进行生理稳定，之后转移至生化培养箱培养20 h。挑选单菌落于分离培养基中，然后置于28～30℃生化培养箱中培养36～40 h，同时用斜面培养基对照试验。在分离培养基不能长出菌落，而在对照培养基中能长出的菌落的即为营养缺陷型突变株称之为特异性单酵母。

1.2.3 目的菌株筛选 取纯培养36～40 h后的菌种接于装有100 mL摇瓶培养基（pH值为6.8）的250 mL的三角瓶中，置于温度为30℃，转速为200 r/min的摇床中摇28 h，从中取10 mL转接到装有100 mL发酵产酒培养基的500 mL的三角瓶中，28～30℃，转速为220 r/min的摇床内摇72～96 h。先用100目滤布过滤，滤液于8 000 r/min离心机上离心5 min，取上清液并测定上清液的酒精度及用色谱测定上清液中的各种糖分含量，选出目的菌株。

1.2.4 发酵力测定 以55型低聚果糖为反应底物，调节至可溶性固形物含量取100 mL，接种量为5%（V/V），于30℃恒温摇床中，转速220 r/min，反应2 h，取出置于100℃水浴5 min灭活酵母菌。8 000 r/min离心5 min，取上清液，用高效液相检测各糖分含量，计算消耗葡萄糖量。在上述条件下，每分钟消耗1 μmol葡萄糖所需酵母菌体的量为一个发酵力单位（U）。

注：X表示发酵力单位，活力单位为U/g；25表示 25%反应底物溶液100 mL的总糖，单位为g；G0表示反应前葡萄糖的百分含量（%）；G1表示反应后葡萄糖的百分含量（%）；0.18表示 1微摩葡萄糖=0.18 mg；t表示反应时间，单位为min；m表示用酵母菌量，单位为g。

1.2.5 平均增殖力测定 按摇瓶培养基配制250 mL，取100 mL，接种量为5%（V/V），于30℃恒温摇床中，转速220 r/min，反应4 h取出置于100℃水浴5 min灭活酵母菌，8 000 r/min离心5 min去上清液后称重量，以接种前为空白对照。在上述条件下，每h增加的重量为平均增殖力单位（mg/h）。

注：式2中，G表示平均增殖力，g0单位为mg/h；g1表示空白试样的重量，单位为mg；表示反应后试样重量，h单位为mg；表示试样反应时间，单位为小时（h）。

1.2.6 酒精度测定 酒精度的测定用酒精计[5]法。

2 结果与分析

2.1 诱变臭氧浓度的选择

臭氧发生器所产生臭氧浓度在半衰期内浓度随时间上升，但到半衰期后随臭氧分子分解，系统达到平衡。试验所用的设备所产生臭氧在仓内设定浓度最大值为35 mg/m3，通过测定臭氧浓度与时间曲线推算得诱变时间。本试验臭氧浓度为0.0 mg/L，5 mg/m3，10 mg/m3，15 mg/m3，20 mg/m3，25 mg/m3，30 mg/m3，35 mg/m3，结果如图1。

图1 臭氧浓度对致死率影响

图1中浓度为15 mg/m3时，致死率为92%，随浓度升高至20 mg/m3致死率已接达到98%，所以选用臭氧浓度为20 mg/m3为诱变条件诱变出发菌株YSS-01，此臭氧浓度对应时间为8 min。

2.2 菌株传代稳定性

通过诱变后，斜面培养筛选出突变株为YSS-02，在分离培养基选出营养缺陷型突变株YSS-03，将两菌株进行传代稳定性验证，通过发酵，测定发酵活力以考察其发酵的稳定性，结果如表1。

表1 营养缺陷型YSS-03稳定性验证结果

从表1可以看出，第1代258 U/g，第5代253 U/g，YSS-03发酵力比较稳定，第0代与第5代相差只有2.5%左右，说明此营养缺陷型突变株是稳定的，并以YSS-03进行发酵产酒研究。

2.3 诱变前后产乙醇对比

在1 000 mL桑果汁中用葡萄糖调节可溶性固形物至280BX，100℃水浴60 min冷却至28～30℃，分别接2.5%原始种YSS-01和营养缺陷型YSS-03，发酵48 h。分别连续试验10批次。测定批次发酵液的酒精度（表2）。从表中可以看出两菌株产酒能力非常稳定，都在13%～16%之间。10批次的平均产酒分别为:菌株YSS-01为14%，营养缺陷型菌株YSS-03为14.5%。可以看出诱变前与诱变后的菌株产酒能力相差不大，诱变后得到的营养缺陷型菌株产酒能力稍有提升。

表2 菌株产酒能力对比

2.4 营养缺陷型突变株增殖力

将25 mL摇瓶培养果酒酵母接到装有500 mL摇瓶液体培养基的1 000 mL三角瓶中，置于30℃，220 r／min的恒温摇床中培养36 h，每4 h称量一次，测定增殖力结果见图2。营养缺陷型果酒酵母的增殖力从开始至20 h一直在上升，但从16 h至20 h增殖相当缓慢，从20 h后增殖力开始加速下降，至36 h时的增殖力只有最高峰的一半左右。由图2可见生长对数期应在8～16 h之间。

图2 培养时间对营养缺陷型果酒酵母增殖力的影响

2.5 营养缺陷型突变株对单糖特异性情况

低聚果糖产品组分中含有葡萄糖、果糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖等混合物。调节低聚果糖液至250BX，取200 mL，接YSS-03菌种5%（V/V）置于30℃，220 r/min的恒温床反应30 h，取出置于100℃水浴灭活10 min。用高效液相色谱检测反应前后的各糖分变化（图3和图4）。从图3中明显看到反应前果糖和葡萄糖含量很高，反应后的图4中可以看出果糖和葡萄糖含量已经很少，而从图4峰面积上看其它糖分含量升高了，是因为葡萄糖和果糖已经被YSS-03消耗，而其它糖分不被消耗或消耗极少。因此对比说明YSS-03具有单糖特异性。

图3 反应前各糖含量谱图

图4 反应后各糖含量谱图

2.6 YSS-03酒精耐受性

2 500 mL桑果汁用55型低聚果糖调节至固形物含量为250BX，分别取200 mL，用95%食用乙醇分别调节乙醇浓度为10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%等11个浓度梯度，接种量为5%（V/V）于25℃～30℃恒温摇床中，转速220 r/min，反应24 h，测定发酵力（图5），结果显示，YSS-03最初发酵力在260U/g左右，由图5看出，乙醇浓度10%时，对YSS-03菌株已经有抑制作用，升至浓度16%只有50%左右的发酵力，浓度17%时发酵力急剧下降，至20%时发酵力几乎完全被抑制。所以YSS-03的酒精耐受在16%～17%之间。

图5 YSS-03对酒精耐受性情况

2.7 温度对YSS-03发酵影响

取5 000 mL桑果汁用55型低聚果糖调节至固形物含量为250BX，分别取200 mL，接种量为5%（V/V），于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃恒温摇床中，转速220 r/min，反应40 h，发酵过程补加两次固形物为250BX的55型低聚果糖。取置于100℃水浴5 min灭活酵母菌。分别测定发酵液中的发酵活力和酒精度（图6）。

由图6看出发酵力和酒精浓度都从开始就上升，发酵力从约90 U/g升到25℃接近220 U/g，升至260 U/g为最高点，此时温度约30℃，之后随温度升高逐渐下降，到45℃时，发酵力小于90 U/g。而酒精浓度从起始2%升到最高浓度15%，此时温度约25℃，之后随温度升高逐渐下降，降到30℃酒精浓度已经降到约13%。发酵力和酒精浓度最高点不同，说明最佳发酵力和最佳产酒温度不在同一温度。温度在25～30℃，发酵力在上升阶段，但上升速度已经减缓，而产酒能力在这温度区间已经从最高点下降。通过综合各种因素，选25～30℃为发酵控制温度。

图6 温度对发酵力和产酒影响

2.8 pH值对发酵进程影响

2 500 mL桑果汁用55型低聚果糖调节至固形物含量为250BX，分别取200mL，用盐酸和碳酸氢钠分别调节 pH值为 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5等10个梯度，接种量为5%（V/V），于25℃～30℃恒温摇床中，转速220 r/min，反应40 h，发酵过程补加两次固形物为250BX的55型低聚果糖。取出于100℃水浴 5 min灭活酵母菌。分别测定发酵液中的酒精浓度和发酵活力（图7）。从图7中可以看出，pH值较低时对发酵力和产酒能力都有抑制作用，随pH值的上升发酵力和产酒能力也上升，pH值升至5.5时者都接近最高值；pH值再上升，发酵力和产酒能力反而下降，但发酵力下降较缓慢，而产酒能力下降较快，说明产酒能力对pH值更敏感。通过图7可以看出最合适发酵得pH值为5.0～5.5。

图7 pH值对发酵影响

3 讨论

3.1 营养缺陷型酵母发酵参数的确定

通过臭氧诱变获得营养缺陷型的果酒酵母，其对单糖具有良好的特异性，保持原有产酒能力，酒精耐受16%以上。并初步确定了酵母菌株的最佳发酵条件：温度为25～30℃，pH值为5.0～5.5，生长对数期在8～16 h。

3.2 营养缺陷型果酒酵母工业应用研究及推广应用

通过实验获得具有工业应用价值株营养缺陷型果酒酵母，并在功能性桑果酒制备上建立了应用示范中试基地。下一步将重点开展菌株工业放大发酵试验，建立相关发酵参数；并对YYS-03增殖细胞进行工业固定化研究，以提高酿酒应用次数，降低工业化应用成本。同时，探索把此菌株推广至更多功能性果酒如葡萄酒红酒、火龙果酒、芒果果酒、香蕉果酒等应用上；此外，还将重点研究此菌株的特性如酵母粘性、生长特性等性质。

［1］马兆瑞，祝战斌，张坐省，等.不同加糖方式和加糖量对苹果酒风味影响[J].酿酒，2003，30（4）:89-90.

［2］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.低聚果糖国家标准[S].北京：中国标准出版社，2009.

［3］杨家蕾，董全 .臭氧杀菌技术在食品工业中的应用[J]，食品工业科技.2009，30（4）：353-359.

［4］米运宏，梁智，蓝伯广，等.臭氧诱变米曲霉产专用制备高纯度低聚果糖酶突变菌株[C].中国淀粉工业协会糖醇专业委员会.五届四次会员大会论文集.南京，2015:105-112.

［5］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.果酒通用分析方法GB/T15038-2006[S].北京：中国标准出版社，2006.

S88；

A；

1006-1657（2016）01-0032-5

］2015-10-25；

2016-01-20

信息］梁贵秋（1975—），女，硕士研究生，高级农业经济师，主要从事蚕桑资源综合利用研发工作。E-mail:liangguiqiu0816@163.com