青春期大鼠髁突软骨内润滑素的表达研究

陈正　涂少勤　卢红飞　麦志辉　陈琳　陈奇

510630 广州，中山大学附属第三医院口腔医学部(陈正，卢红飞，麦志辉，陈琳，陈奇)；518000佛山，广东省佛山市口腔医院正畸科(涂少勤)



青春期大鼠髁突软骨内润滑素的表达研究

陈正涂少勤卢红飞麦志辉陈琳陈奇

510630 广州，中山大学附属第三医院口腔医学部(陈正，卢红飞，麦志辉，陈琳，陈奇)；518000佛山，广东省佛山市口腔医院正畸科(涂少勤)

【摘要】目的研究无干预措施下青春期大鼠髁突软骨内润滑素的表达情况。方法选取5组5周龄的雌性SD大鼠(每组5只)，软食喂养下分别于3、7、14、21和30 d处死，下颌骨髁突制作切片，行苏木素-伊红(HE)染色及Envision二步法进行免疫组织化学染色检查，应用倒置相差光学显微镜、光学显微照相系统观察和拍摄图片，测量润滑素阳性区域的累积光密度值，比较不同实验时点润滑素的表达情况。结果大鼠髁突软骨细胞具有独特的层域化分带；髁突全层均有润滑素的表达，其中静止层仅见少量润滑素表达；纤维层中，润滑素聚集在最表层细胞的细胞浆中；增殖层中，润滑素分布于整个软骨细胞中；肥大层中，润滑素分布于肥大的软骨陷窝内细胞质中，浅肥大层表达较强，靠近深肥大层逐渐减弱。在相同时点，髁突后部软骨增殖层润滑素阳性区域的累积光密度值均高于肥大层润滑素的累积光密度值(P均<0.05)；在不同时点，髁突后部增殖层和肥大层润滑素阳性区域的平均累积光密度均无明显变化(P均>0.05)。结论在青春期SD大鼠髁突软骨中，润滑素表达水平呈现一定的连续性和稳定性，这为髁突生理性改建、下颌骨正常发育提供了良好的内环境。

【关键词】青春期大鼠；髁突软骨；润滑素

下颌骨发育不足是骨性Ⅱ类错牙合畸形常见表现形式，作为人体骨骼系统的一部分，下颌骨的生长速度在青春期达到高峰，此时若给予合适的导下颌向前的功能矫治，刺激髁突生长，实现下颌骨体量的增大是实现治疗目标的一种常见方式。髁突作为颞下颌关节的重要组成部分，受到关节内环境的影响[1]。近期研究表明，润滑素在关节组织的正常生理功能中起到关键性的作用，其作为一种边界润滑剂，不仅可改变关节滑液的流变学性能，释放关节软骨所受的机械负荷，还可直接影响关节软骨的代谢、保护软骨表面完整性，是实现关节生理性改建的重要环节[2-3]。本研究通过检测青春期SD大鼠髁突软骨后部的润滑素表达情况，初步探讨正常发育时髁突软骨内润滑素表达水平，旨在为后续阐明功能矫治下颌后缩机制提供参考依据。

材料与方法

一、实验动物

选取25只5周龄远交系Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠，体质量(100±5)g，由中山大学动物实验中心提供。实验动物饲养于中山大学北校区实验动物中心SPF级实验室，动物的处置符合实验动物福利伦理原则。

二、主要仪器与试剂

包括：日本OLYMPUS 1X71倒置相差光学显微镜及OLYMPUS光学显微照相系统，格兰仕微波炉，石蜡切片机，展片机，生物组织包埋机，电热鼓风干燥箱；兔抗润滑素多克隆抗体(Abcam公司，英国)，GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒[基因科技(上海)有限公司]。

三、方法

1. 实验分组

将25只5周龄SD雌性大鼠随机分为5组(3、7、14、21和30 d)，每组5只。各组间小鼠体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组动物分笼饲养，软食喂养，可自由饮水。

2. 组织准备

实验动物分别用软食饲养3、7、14、21和30 d，用10%水合氯醛(按0.3 ml/100 g体质量)腹腔麻醉后，经心内插管灌注生理盐水后再灌注10%中性甲醛固定液(约300 ml)。切下动物头部，在同样的固定液中浸泡过夜。沿头部正中矢状面切开头部成两半后，分别在10%依地酸二钠(EDTA，pH 7.4)室温下脱钙6～8周，每周换1次脱钙液。脱钙后去除颞下颌关节区周围的组织，暴露大鼠下颌升支及髁突。常规脱水，包埋于石蜡中，平行于矢状面切颞下颌关节成3 μm厚。选取石蜡切片平铺于硅化玻片上，在60℃下恒温2 h以确保组织能够黏附到载玻片上，备用。

3. 苏木素-伊红染色和免疫组织化学染色

常规将标本脱蜡、水化、苏木素-伊红染色、封片。

采用Envision二步法进行免疫组织化学染色检测，标本脱蜡、水化、将切片置于3%过氧化氢中，微波炉低火档加热3 min，以去除内源性过氧化物酶，用1∶50稀释的EDTA修复液(pH 9.0)进行抗原热修复，磷酸盐缓冲液冲洗后，滴加50 μl HRP二抗(Dako Envision复合物)，37℃湿盒孵育30 min，加二氨苯联胺(DAB)溶液显色液(按1∶50稀释)，显微镜下观察显色，自来水中止显色，用苏木素溶液复染。人肝组织切片(来源于中山大学附属第三医院病理科)按上述步骤进行染色作为阳性对照；颞下颌关节石蜡切片以磷酸盐缓冲液代替一抗按上述步骤进行染色作为阴性对照。

4. 观察内容及评价标准

据文献报道，髁突软骨后上部是髁突生长以及引导下颌向前治疗后发生改变最明显的部位[4]。故本实验主要检测髁突后上部润滑素表达变化。

免疫组化染色的评价标准：显微镜下观察，润滑素阳性区域定位于髁突软骨细胞质，阳性反应呈棕黄色；人肝组织切片的细胞质呈棕黄色染色；阴性对照切片无棕黄色染色。应用OLYMPUS 1X71倒置相差光学显微镜、光学显微照相系统观察和放大40～400倍拍摄图片，图像使用Photoshop CS4图像处理软件，在平行于髁突软骨细胞分层界线分别在髁突后上部的增殖层和肥大层随机选择3个350像素×100像素固定大小的区域，导入Image Pro-Plus软件中测量润滑素阳性区域的累积光密度值(IOD)。以阳性区域IOD与图片面积的比值作为指标。

四、统计学处理

结果

一、髁突软骨的组织形态特点

髁突软骨表面包绕一层纤维组织即关节盘，对应于关节盘后带略靠后部位的软骨组织最厚，髁突软骨由后向前逐渐变薄。髁突软骨细胞具有独特的层域化分带，根据软骨细胞形态，髁突由浅至深可分5层，分别为纤维层、静止层、增殖层、肥大层和移行层，各层之间相互移行，见图1、2。

图1　青春期大鼠髁突软骨组织的

A、M、P分别对应髁突软骨的前、中、后部

图2　青春期大鼠髁突后部软骨组织的

A、R、P、H、Z分别对应髁突软骨的纤维软骨层、静止层、增殖层、肥大层和移形层

二、髁突全层润滑素的表达情况

1. 镜下观察

青春期大鼠中，髁突的全层均有润滑素的表达，髁突后部表达明显，在其静止层仅见少量润滑素表达；在纤维层中，润滑素聚集在最表层细胞的细胞浆中，镜下呈扁平状，与髁突软骨关节面平行；在髁突软骨增殖层中，润滑素分布于整个软骨细胞中；在髁突软骨肥大层中，润滑素分布于肥大的软骨陷窝内细胞质中，浅肥大层表达较强，靠近深肥大层逐渐减弱，见图3、图4。

图3　青春期大鼠髁突软骨组织的

A、M、P分别对应髁突软骨的前、中、后部

2. 定量分析

髁突后部各时点的软骨增殖层润滑素阳性区域的IOD分别高于相应时点的肥大层润滑素IOD(P均<0.05)；髁突后部增殖层和肥大层润滑素阳性区域的IOD在不同时点组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1、图5。

图4　青春期大鼠髁突后部软骨组织的病理切片(IHC染色，A×200,B、C×400)

A、R、P、H、Z分别为髁突软骨的纤维软骨层、静止层、增殖层、肥大层和移形层，黑色箭头所示为润滑阳性表达；B、C分别为P、H层中黑色选框放大图像

表1　增殖层和肥大层组内、组间润滑素表达水平的比较±s,n=5)

图5　青春期大鼠髁突后部软骨润滑素表达水平的比较

增殖层和肥大层润滑素表达水平比较，*P<0.05

讨论

骨性Ⅱ类错牙合畸形常表现为上颌前突、下颌后缩的突面面型，其中下颌发育不足尤为明显。对于此类成年患者，临床上通常采取正颌手术延长下颌骨长度，而对处于青春期或青春前期的患者，则采用引导下颌向前的功能矫治以刺激下颌骨的生长发育，达到上、下颌骨骨量协调的目的。作为下颌骨的主要生长区域以及颞下颌关节的重要组成部分，髁突的生长改建与关节的负荷环境息息相关，而颞下颌关节是一种滑液关节，在正常咀嚼、言语等口腔正常功能运动时受到各种机械负荷。覆盖于颞下颌关节表面的关节盘和关节软骨以及关节腔内的滑液可有效吸收和分散下颌功能运动中对颞下颌关节区造成的负荷。其中，良好的关节润滑机制是维持颞下颌关节正常功能运动和长期健康的重要因素。作为关节润滑机制的重要组成部分，边界润滑是指在关节负荷持续存在，关节软骨的部分表面接触时，由液膜润滑过渡到干摩擦(软骨表面直接接触)过程之前的临界状态，是关节润滑的最后阶段[5]。软骨表面的润滑素作为一种边界润滑剂，具有润滑关节的作用，是关节边界润滑的关键[6]。体内和体外的研究均表明，润滑素可减小摩擦力，为关节滑液提供分散由于运动产生的应变能的能力，具有保护关节作用[7]。Leonardi等[8]通过对无退行性变的人颞下颌关节组织切片研究发现，润滑素在颞下颌关节盘中间带表层区域的表达量明显高于中心区域，而且在关节盘中间带中心区域的细胞周围的细胞外基质中发现润滑素的表达。

本研究中，选取的SD大鼠属于啮齿类动物，其与人类的颞下颌关节在组织结构具有高度相似性，生长周期较短，且较易获得样本量，是研究人颞下颌关节的理想动物模型[9]。本研究时间为大鼠5～9周龄，这个时间段包含髁突快速生长的阶段，也覆盖了SD大鼠的整个青春期，可代表临床应用功能矫治器的大部分患者年龄段。研究结果显示，青春期SD大鼠髁突后部软骨细胞质中含有润滑素的表达，并且在整个青春期没有明显变化。本研究还发现，在髁突软骨增殖层和肥大层软骨细胞质有润滑素表达，与Ohno等[10]关于润滑素在髁突软骨的表达的研究结果相同。这提示，SD大鼠髁突软骨中润滑素表达水平在青春期呈现一定的连续性和稳定性，为颞下颌关节提供持续、有效的边界润滑能力，可有效地减少颞下颌关节运动过程的负荷，从而提供了颞下颌关节生长、发育所需要的稳定内环境。但是，润滑素在髁突软骨增殖层和肥大层中表达的具体作用及机制仍需要进一步的研究阐明。

参考文献

[1]Embree M, Ono M, Kilts T, Walker D, Langguth J, Mao J, Bi Y, Barth JL, Young M.Role of subchondral bone during early-stage experimental TMJ osteoarthritis.J Dent Res,2011,90(11):1331-1338.

[2]Ruan MZ, Erez A, Guse K, Dawson B, Bertin T, Chen Y, Jiang MM, Yustein J, Gannon F, Lee BH.Proteoglycan 4 expression protects against the development of osteoarthritis.Sci Transl Med,2013,5(176):176ra34.

[3]Alquraini A, Garguilo S, D’Souza G, Zhang LX, Schmidt TA, Jay GD, Elsaid KA.The interaction of lubricin/proteoglycan 4 (PRG4) with toll-like receptors 2 and 4: an anti-inflammatory role of PRG4 in synovial fluid.Arthritis Res Ther,2015,17:353.

[4]Oksayan R, Sokucu O, Ucuncu N.Effects of bite-jumping appliances on mandibular advancement in growing rats: a radiographic study.Eur J Dent,2014,8(3):291-295.

[5]Tanaka E, Detamore MS, Tanimoto K, Kawai N.Lubrication of the temporomandibular joint.Ann Biomed Eng,2008,36(1):14-29.

[6]Hayashi M, Zhao C, Thoreson AR, Chikenji T, Jay GD, An KN, Amadio PC.The effect of lubricin on the gliding resistance of mouse intrasynovial tendon.PLoS One,2013,8(12):e83836.

[7]Bonnevie ED, Galesso D, Secchieri C, Cohen I, Bonassar LJ.Elastoviscous Transitions of articular cartilage reveal a mechanism of synergy between lubricin and hyaluronic acid. PLoS One,2015,10(11):e0143415.

[8]Leonardi R, Musumeci G, Sicurezza E, Loreto C.Lubricin in human temporomandibular joint disc: an immunohistochemical study.Arch Oral Biol,2012,57(6):614-619.

[9]Porto GG, Vasconcelos BC, Andrade ES, Silva-Junior VA. Comparison between human and rat TMJ: anatomic and histopathologic features.Acta Cir Bras,2010,25(3):290-293.

[10]Ohno S, Schmid T, Tanne Y, Kamiya T, Honda K, Ohno-Nakahara M, Swentko N, Desai TA, Tanne K, Knudson CB, Knudson W.Expression of superficial zone protein in mandibular condyle cartilage.Osteoarthritis Cartilage,2006,14(8):807-813.

(本文编辑：林燕薇)

Study of the expression of lubricin in condylar cartilage of puberty rats

ChenZheng,TuShaoqin,LuHongfei,MaiZhihui,ChenLin,ChenQi.

DepartmentofStomatology,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,ChinaCorrespondingauthor,ChenZheng,E-mail: 278467653@qq.com

【Abstract】ObjectiveTo detect the expression of lubricin in the condylar cartilage of the puberty rats without interventions. MethodsTwenty five 5-week-old female Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into five groups (n=5). The animals were fed with ground pellets and sacrificed on 3-, 7-, 14-,21-and 30-d. The mandibular condyle tissues were prepared for H.E and immunohistochemical staining. Under inverted optical microscope, integrated optical density (IOD) of the area of positive lubricin was quantitatively analyzed. The expression levels of lubricin were measured and compared at different time points. ResultsCondylar cartilages presented with varying characteristics among different layers. Lubricin was expressed throughout the whole condyle. Lubricin was slightly expressed in the static zone. In the articular fibrous zone, lubricin was abundant in the chondrocyte cytoplasm of the superficial layer. In the proliferative zone, lubricin was distributed throughout the condylar cartilages. In the hypertrophic zone, lubricin was observed in the cytoplasm of hypertropic cartilage lacuna, with higher expression in the superficial layer than the deep layer. At the same time point, IOD values of the positive lubricin area in the proliferative zone were significantly higher compared with those in the hypertrophic zone of the posterior mandibular condyle (all P<0.05). In both the proliferative and hypertrophic zones, no significant changes were documented in the IOD values at varying time points (all P>0.05). ConclusionIn the condylar cartilage of the puberty SD rats, lubricin was stably and continuously expressed, creating a sound inner environment for physiological reconstruction of mandibular condyle and normal growth of the mandible.

【Key words】Puberty rats; Condylar cartilage; Lubricin

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.05.010

基金项目：广东省医学科学技术研究基金(201333)

(收稿日期：2016-01-18)

·基础研究论著·

通讯作者，陈正，E-mail：278467653@qq.com