镉胁迫对黄颡鱼幼鱼抗氧化酶活性及免疫应答的影响

朱星樽，黎明，袁莉霞，李冰，陈雨诗，谢雨欣，王日昕

（1.东北师范大学生命科学学院，吉林长春130024；2.宁波大学海洋学院，浙江宁波315211）

镉胁迫对黄颡鱼幼鱼抗氧化酶活性及免疫应答的影响

朱星樽1，2，黎明2，袁莉霞2，李冰2，陈雨诗2，谢雨欣2，王日昕2

（1.东北师范大学生命科学学院，吉林长春130024；2.宁波大学海洋学院，浙江宁波315211）

为了研究急性镉（Cd2+）胁迫对黄颡鱼幼鱼肝脏抗氧化酶活性及非特异性免疫应答的影响，实验挑选初始体质量为（5.94±0.05）g的健康黄颡鱼幼鱼，随机分成2个处理组，每组设置3个重复，开展为期96 h的急性Cd2+胁迫实验。结果表明：高Cd2+组实验鱼肝脏中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶活性在6 h时达到最高，而硫代巴比妥酸反应物含量在12 h时达到最高；高Cd2+组实验鱼肝脏中溶菌酶（LYZ）、碱性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）活性显著低于低Cd2+组；高Cd2+组实验鱼肝脏中LYZ、AKP及ACP活性最低值出现在48～96 h。研究表明，急性Cd2+胁迫产生的大量自由基并不能被机体自身的抗氧化酶体系完全清除；高Cd2+浓度会对抗氧化和免疫应答体系造成不同程度的抑制。

镉；抗氧化酶；免疫应答；黄颡鱼

环境中的镉（Cadmium，Cd）是一种具有遗传毒性的重金属，被国际癌症研究会（IARC）列为I级致癌物[1]。环境中的Cd2+主要来源于工、农业生产，由于环境中的Cd2+不能被微生物降解，随着工农业生产的发展，环境中的Cd2+含量逐年上升，尤其是污染的重灾区——江、河、湖泊及地下水等，而它们往往是城市饮用水的主要来源，监测水环境中Cd2+污染的程度显得尤为重要。在环境评测中，生物检测的作用日益受到关注。迄今，有关重金属污染的生物检测，主要集中在重金属富集等研究方面，国内鲜有研究从生理学的角度，将动物的代谢紊乱、氧化损伤及免疫抑制等列入评价指标。事实上，作为环境污染的直接参与者，水生动物生理的变化，能够直接或间接在一定范围人群中表现出来。

利用鱼体内生理反应中关键酶的活性来验证污染物对生物的影响，将其作为环境评价手段，国外不少学者已进行了许多有益的探索。近年来，越来越多的研究将目光集中到氧化损伤和免疫抑制的评价上。超氧化物歧化酶（SOD）是生物体内唯一以直接自由基作为底物的酶，能够将超氧阴离子（Superoxide anion）通过歧化反应转变为H2O2，但H2O2是具有细胞毒性的，一方面，机体能够通过过氧化物酶（CAT）途径将H2O2催化生成H2O和O2，另一方面，通过谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）途径将H2O2催化生成H2O[2]。然而，徐立红等[3]推测，重金属Cd2+能够直接作用于抗氧化酶系统，导致氧化损伤、炎性应激及免疫抑制，但尚未提供直接的证据。

黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco是我国重要的经济养殖鱼类，为杂食偏肉食性，在我国长江和珠江流域自然水体中分布较为广泛，其肌肉中含有人体所需的多种必需氨基酸，尤其是没有肌间刺的优点，深受广大老百姓的喜爱。黄颡鱼具有的较强氨氮耐受能力的特质，使其成为开展本研究绝佳的实验对象。本研究以黄颡鱼幼鱼为研究对象，开展为期96 h的急性Cd2+胁迫实验，试图探究Cd2+对鱼类抗氧化酶系统及免疫应答系统的影响程度，以期对环境监测及鱼类生理学研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 预实验、养殖管理及取样

黄颡鱼幼鱼（5.94±0.05）g购自浙江嘉兴，暂养30 d后，设置4个Cd2+水平：0.005，0.05，0.5和5 mg/L（参考国家渔业水质标准中所规定的Cd2+离子浓度为0.005 mg/L，3个浓度组分别为标准浓度的10、100和1 000倍），每个水平设置3个重复，每个重复30尾鱼，96 h后统计累计死亡率，通过软件拟合，获得半致死浓度为2.4 mg/L Cd2+，用于正式实验。

挑选大小均匀、体格健壮的鱼苗，随机分配到6个300 L塑料养殖桶中（每个处理设置3个重复），每桶40尾。实验共设置2个Cd2+水平：0.005（对照）和2.4 mg/L Cd2+。养殖过程中，养殖用水为除氯自来水，每天更换相同Cd2+浓度的水，日换水量为总体积的1/3，水温27～29℃，溶氧（7.58±0.15）mg/L，亚硝酸盐<0.5 mg/L，保持自然光照。胁迫周期为96 h。

取样时间点包括：0，6，12，24，48和96 h。在每一个取样时间，每缸随机挑选3尾鱼，MS-222（120 mg/ L）麻醉后，解剖获得肝脏，保存于-20℃备用。

1.2 抗氧化酶活性及过氧化程度分析

称取0.1 g肝脏样品，放入预冷的磷酸缓冲液（50 mM，pH 7.4）中匀浆，匀浆液于4℃环境中2 000 r/min离心15 min分离上清液备测。超氧化物歧化酶（SOD）的测定参考BEAUCHAMP,et al[4]报道的方法；过氧化氢（CAT）的测定参考AEBI[5]报道的方法；谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）的测定参考FLOH魪,et al[6]报道的方法；谷胱甘肽还原酶（GR）的测定参考CHING,et al[7]报道的方法；硫代巴比妥酸反应物（TBARS）的测定参考BUEGE,et al[8]报道的方法。所有分析均采用商业试剂盒（南京建成生物工程研究所），严格按照说明书步骤进行。

1.3 溶菌酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶活性分析

称取0.1 g肝脏样品，放入预冷的磷酸缓冲液（50 mM,pH 7.4）中匀浆，匀浆液于4℃环境中2 000 r/min离心15 min，分离上清液备测。溶菌酶（LYZ）活性测定参考HULTMARK,et al[9]报道的方法；碱性磷酸酶（AKP）活性测定参考ENGSTAD,et al[10]报道的方法；酸性磷酸酶（ACP）活性测定参考GROVE,et al[11]报道的方法测试分析采用商业试剂盒（南京建成生物工程研究所），操作步骤严格按照说明书进行。

1.4 统计分析

实验结果以平均值±标准误（mean±S.E.）表示，差异显著性设置P<0.05。镉胁迫浓度差异采用t检验进行统计学处理；镉胁迫时间差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA），采用邓肯检验（Duncan's Multiple Range test）对显著性差异进行比较。所有分析均采用SPSS 18.0.0（Chicago,USA）在Windows操作系统中进行。

2 结果

低Cd2+组（对照组）实验鱼肝脏中SOD、CAT、GPX和GR活性及TBARS含量在96h实验周期内并未检测出显著性差异（表1，P>0.05）；高Cd2+组（实验组）实验鱼肝脏中SOD、GPX和GR活性在6 h时达到最高，随后逐渐降低（P<0.05），其中，SOD和GR活性在12～96 h之间无显著性差异（P>0.05）；高Cd2+组实验鱼肝脏中TBARS含量在12 h时达到最高，随着胁迫时间的延长（P<0.05），并未发生显著性变化（P>0.05）。高Cd2+组实验鱼肝脏中CAT活性在各取样时间点之间无显著性差异（P>0.05）。

表1 镉胁迫不同时间黄颡鱼肝脏抗氧化酶活性及脂质过氧化程度Tab.1Liver antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation levels at different times in Pelteobagrus fulvidraco during

高Cd2+组实验鱼肝脏中LYZ、AKP和ACP活性显著低于低Cd2+组（表2，P<0.05）；低Cd2+组实验鱼肝脏中LYZ、AKP和ACP活性在96 h实验周期内并未检测出显著性差异（P>0.05）；高Cd2+组实验鱼肝脏中LYZ活性在3 h时达到最高，随后逐渐降低，最低值出现在48～96 h（P<0.05）；高Cd2+组实验鱼肝脏中AKP和ACP活性随着胁迫时间的延长呈下降趋势，最低值出现在48～96 h（P<0.05）。

表2 镉胁迫不同时间黄颡鱼免疫应答能力Tab.2Nonspecific immune responses at different times in P.fulvidraco during 96 h exposure to high or low concentrations of environmental ammonia

3 讨论

前人的研究认为，水生动物重金属中毒效应主要体现在自由基介导的氧化损伤[3,12]。环境中的Cd2+通过鳃、皮肤等组织进入动物体内，能够激活N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDA），继而产生大量的自由基（ROS），导致蛋白质结构破坏[13]及细胞膜过氧化[14]，主要原因是过氧化产物—醛酮类物质的过度积累，它能够与蛋白质、核酸及磷脂发生交联聚合，导致细胞毒性，加速细胞和组织功能的丧失[8]。本研究发现，高Cd2+组实验鱼肝脏中TBARS含量随着胁迫时间的延长，呈不断升高趋势，表明组织过氧化程度与Cd2+毒性积累存在明显的剂量依赖效应，这种现象很可能是造成鱼类Cd2+中毒死亡的主要原因之一。正常情况下，鱼类清除ROS依赖一些抗氧化酶类，包括：超氧化物歧化酶、过氧化物酶及谷胱甘肽过氧化物酶[15]。SOD能够将超氧阴离子转变为H2O2，阻止ROS对机体的直接伤害，随后，机体通过CAT途径（催化H2O2生成H2O和O2）和GPX途径（催化H2O2生成H2O）进一步清除有毒的H2O2[2]。本研究发现，肝脏中抗氧化酶活性随着胁迫时间的延续，呈现先升高后降低的趋势。徐立红等[3]研究认为，Cd2+能够直接作用与细胞的抗氧化酶系统。因此本研究发现的高Cd2+组实验鱼肝脏中SOD、GPX和GR活性在前6 h内表现出的升高趋势，很可能是一种毒性兴奋效应。然而，随着Cd2+胁迫时间的延续，高Cd2+组实验鱼肝脏中抗氧化酶活性逐渐趋于稳定，这种肝脏组织中抗氧化酶活性出现的“饱和”现象很可能是动物应对“重金属中毒”进化出的一种适应性保护机制[16]。

刘艳平等[17]认为，随着环境中Cd2+浓度升高，鳙鱼血细胞的微核细胞率升高，表现出明显的量效关系。陈昌玉等[18]发现，Cd2+能诱导胭脂鱼血细胞发生典型的凋亡，而且细胞凋亡率与Cd2+的浓度和处理时间成明显的剂量-效应关系。本研究也获得了相同的结果，高Cd2+组实验鱼肝脏中LYZ、AKP和ACP活性显著低于对照组。本研究还发现，高Cd2+组实验鱼肝脏中LYZ、AKP和ACP活性在48 h前并未出现显著下降趋势，而48 h后均表现出不同程度的下降趋势，本研究推测可能是鱼类遭受Cd2+刺激后，外围淋巴组织中会产生大量免疫抑制因子，随着胁迫程度加剧，免疫抑制因子会被逐渐释放到血液中，影响淋巴细胞和巨噬细胞的含量和活性，使得免疫应答受到抑制。本研究结果与LI Ming,et al[19]在环境氨氮对黄颡鱼免疫力影响研究中的发现是一致的：从0 h到7 d，暴露在氨氮环境中的黄颡鱼免疫应答并未发现显著性差异，但14 d后，免疫应答活性突然降低，他们认为这可能是因为免疫抑制的发生需要一定的时间。当鱼类暴露到氨氮环境中，大量的免疫抑制因子在外围淋巴组织中产生后被逐渐被释放到血液中。然而，由于受到实验鱼种类、大小及环境胁迫因子不同等影响，要彻底阐明Cd2+胁迫对鱼类免疫应答能力的影响机制，尚需要更多的证据。

综上，黄颡鱼幼鱼遭受半致死浓度的急性Cd2+胁迫，高Cd2+组黄颡鱼肝脏中硫代巴比妥酸反应物的过度积累表明，应激产生的大量自由基并不能被机体自身的抗氧化酶体系完全清除；高Cd2+浓度还会对抗氧化体系造成不同程度的抑制，而抗氧化酶体系出现的“饱和”现象很可能是动物应对“重金属中毒”进化出的一种适应性保护机制；半致死浓度的急性Cd2+胁迫会对黄颡鱼幼鱼的免疫应答体系造成抑制，免疫抑制的发生需要一个过程，与免疫抑制因子是逐渐释放的机制有关。

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Effect of Ammonia Stress on Antioxidant Enzyme Activity and Immune Response in Juvenile Pelteobagrus fulvidraco

ZHU Xing-zun1,2,LI Ming2,YUAN Li-xia2,et al
(1.School of Life Sciences,Northeast Normal University,Changchun130024;2.College of Marine Science, Ningbo University,Ningbo315211,China)

A study was carried out to test the responses of juvenile Pelteobagrus fulvidraco to Cd2+stress. The catfish(5.94±0.05)g were randomly allocated to 2 groups(control group and exposure group)in triplicate for 96 h Cd2+exposure.In high Cd2+group,the highest significant liver SOD,GPX and GR activities were found at hour 6,but TBARS was found at hour 12.Liver LYZ,AKP and ACP activities of fish in the treatment of high Cd2+were lower than those of fish in the treatment of low Cd2+.In high Cd2+group,the highest significant liver LYZ,AKP and ACP activities were found at hours 48-96.This study indicated that Cd2+-induced ROS generation is not fully counteracted by antioxidant enzymes.High Cd2+exerts its toxic effects by interfering with antioxidant enzyme and immune response system.

Cd;antioxidant enzyme;immune response;Pelteobagrus fulvidraco

S917.4

A

1008－830X(2016)06－0478－05

2016-09-10

国家自然科学基金（31502176）

朱星樽（1990-），男，吉林通化人，硕士研究生，研究方向：生态学.

王日昕.E-mail:wrx_zjou@163.com