非甾体类抗炎药NS398对胃癌细胞株SCG7901的影响

范占彬隆尧县医院普外科，河北隆尧　055350



非甾体类抗炎药NS398对胃癌细胞株SCG7901的影响

范占彬
隆尧县医院普外科，河北隆尧055350

［摘要］目的探讨环氧合酶抑制剂NS398对胃癌细胞株SCG7901的生物学行为的影响。方法2014年6—12月于河北医科大学第二医院实验室，用MTT、DNA梯度降解试验及流式细胞仪等方法，研究NS398对胃癌细胞株SCG7901的抑制增殖、促进凋亡作用。结果NS398对胃癌细胞株SCG7901产生明显的生长抑制作用，且表现为剂量依赖性（F=35.984，P＜0.01）；DNA梯度降解试验、流式细胞仪分析NS398浓度依赖性地诱导了胃癌细胞株SCG7901凋亡（F= 12.414，P＜0.01），且凋亡与细胞周期受阻有关（F=21.315，P＜0.01），主要阻止在S/G2期。结论NS398对胃癌细胞株SCG7901具有显著浓度依赖性的体外生长抑制、诱导凋亡、阻滞DNA合成作用。

［关键词］环氧合酶-2；非甾体类抗炎药NS398；胃癌细胞株SCG7901

临床流行病学调查、大量实验研究表明：非甾体抗炎药（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）能降低消化道肿瘤的发病率，其抑癌机制包括阻断血管生成、促进细胞凋亡、调控炎症和免疫反应，以赛来昔布为主要药物目前研究比较热门，但NS398作用于胃癌细胞株SCG7901今未有研究，该实验于2014年6—12月于河北医科大学第二医院实验室，用MTT、DNA梯度降解试验及流式细胞仪等方法，研究NS398对胃癌细胞株SCG7901的抑制增殖、促进凋亡作用，来进一步探讨NSAIDs的抑癌机制，现报道如下。

表1　不同浓度NS398在不同时间的Ishikawa细胞的抑制率［（±s），%］

表1　不同浓度NS398在不同时间的Ishikawa细胞的抑制率［（±s），%］

NS398（μmol/L）0 h 12 h 24 h 36 h 48 h　72 h 0（n=10）50（n=20）100（n=20）150（n=20）200（n=20）1.20±0.15 1.21±0.13 1.23±0.14 1.25±0.30 1.32±0.18 1.19±0.22 7.25±0.52 9.89±0.66 12.13±0.63 18.58±0.35 1.22±0.20 12.58±0.45 16.53±1.35 21.08±1.12 28.98±1.29 1.26±0.19 15.45±1.26 26.16±0.32 31.62±0.82 41.23±0.35 1.30±0.15 28.55±0.36 38.43±0.63 48.13±1.32 52.53±1.63 1.45±0.18 33.63±0.53 41.27±0.73 61.63±1.58 70.32±0.14

1　资料与方法

1.1一般资料

选择的NS398纯品是在美国Sigma公司购买的，培养基RPMI1640也是在Sigma公司购买，此外，RNase、1kb DNA ladder、碘化丙啶（PI）试剂是在深圳的晶美公司购买。

1.2细胞系

SGC7901细胞株由中国协和医科大学细胞中心提供，本实验室常规传代培养，10%胎牛血清，37℃，5%CO2培养箱中培养，都是贴壁生长。

1.3细胞生长

曲线-MTT法通过96孔板，每个孔板进行104到105个细胞的接种，在37℃的环境下，在CO2孵箱中，进行12～24 h的培养，然后选择浓度不同的NS398，让其终浓度分别为0、50、100、150、200 μmol/L，来处理细胞，取不同时间，来空白对照不接种细胞和只含有0.1%二甲基亚砜（DMSD）的阴性对照组，每个浓度都设置3个复孔。在确定作用时段后，将里面的培养基去掉，并在每个孔中进行MTT溶液（5 g/L）20 μL，进一步的进行孵育4 h，并终止培养。然后再培养上清，并将150 μL DMSO添加到每一个孔中去，震荡10 min，然后利用酶联免疫检测分析仪来合理的检测每一个孔的实际吸光度值并绘制其生长的曲线，从而增加抑制率的准确性。其计算方式为：抑制率（%）=（1-实验组平均A值/对照组平均A值）×100%。

1.4DNA梯形电泳检测细胞凋亡

按照每瓶104～105个细胞的标准，取指数生长期的SGC7901单细胞悬液，将其接种在25 cm3的培养瓶中，进行24 h的常规培养，进行实验用培养液，也就是浓度不同的NS398，培养72 h，0.25%的胰蛋白酶消化，并根据需要手机细胞，利用酚以及氯仿抽提法来将其中的DNA提取出来，取10 μL，在1.2%的琼脂糖凝胶下电泳检测，在电压100 V的情况下进行3 h。然后分析溴乙锭染色情况，并在紫外灯环境下根据需要拍摄照片。 1.5流式细胞仪（FCM）检测细胞周期及细胞凋亡PI染色法

SGC7901和浓度不同的NS398（浓度分别为0、50、100、150、200 μmol/L）作用24 h后。0.25%胰酶被消化，可以收集并制作105个细胞单细胞悬液，将六孔板中的单细胞悬液收集起来，经过两侧的PBS洗，进行200 uL RNaseA（1 g/L）的加入，在37℃的情况下水浴30 min，然后将100 ug/mL染色液添加进去，进行30 min的避光反应后。上机检测。

1.6统计方法

运用统计学软件SPSS 17.0来处理统计结果。计量资料表示为均数±标准差（±s），MTT法检测结果采用两样本Student's-t检验，FCM检测结果采用方差分析法检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

①NS398会影响SGC7901细胞的增殖和凋亡情况，浓度不同给SGC7901造成的影响时间也各不相同，并且还应该通过吸光度来合理计算细胞的实际抑制率。结果呈现在表1中，在进行统计学分析后，可以发现，组间不同差异具有统计学意义（F=35.984，P＜0.01）。

②100 umol/LNS398作用于SCG7901的过程中，随着时间的变化，DNA的电泳图亮度特征也会发生比较大的变化，属于特征性凋亡梯形图。如图1。浓度不同的NS398在对SCG7901进行24 h的处理之后，通过流式细胞仪检测可以发现，在G2期出现凋亡峰，，0、50、100、150、200 umol/L各浓度的NS398处理后细胞的凋亡率（%）分别为（1.4±0.32）、（12.5±2.17）、（32.1±5.08）、（57.2± 0.83）、（76.6±3.59）。处理组间的差异具有统计学意义（F= 12.414，P＜0.01）。

图1　DNA电泳检测细胞凋亡图

③细胞周期分布情况，SCG7901细胞分为NS398未处理对照组以及处理组，通过浓度不同的NS398例对SCG7901进行24 h的处理后，经过流式细胞仪金细胞检测，在周期中百分率比较由表2较为直观的展示了出来。也直接表明细胞周期不同，组间差异具有统计学意义（F=21.315，P＜0.01）。

表2　不同浓度NS398组SCG7901细胞在各周期分布比例的比较［（±s），%］

表2　不同浓度NS398组SCG7901细胞在各周期分布比例的比较［（±s），%］

0（n=10）50（n=20）100（n=20）150（n=20）200（n=20）NS398（μmol/L）7.13±1.14 6.15±0.85 5.05±0.72 4.83±0.64 2.45±0.18 G0期42.17±0.56 55.35±0.45 65.82±0.36 73.62±0.53 87.16±0.42 G1期24.12±0.25 21.42±0.35 16.23±1.28 13.26±0.77 10.23±0.34 26.58±0.29 17.08±0.38 12.9±0.35 8.29±0.76 0.16±0.05 S期　G2期

3　讨论

随着分子生物学和细胞生物学的出现和发展，对于肿瘤细胞而言，炎症介质前列腺素会发挥很大的作用，在PGs中，COX-2作为合成催化酶非常重要，现在人们已经切实认识到其对于肿瘤的重要性。现在，很多人都已经认可COX-2表达和肿瘤出现、发展、转移和对放化疗本身的敏感性有着直接关系［1-2］。通过非甾体抗炎药的使用能够选择性的对COX-2的表达进行抑制，从而进行PGs的抑制，阻碍肿瘤进一步的生长，近年来胃癌发病率有上升趋势，COX-2选择性抑制剂NS398能够很好的抑制体外培养的为癌细胞，希望能够给胃癌治疗更好的进行提供新的手段［3-5］。

非甾体抗炎药NS398是高选择性COX-2抑制剂，对COX-2有较强的抑制作用。许多研究表明NS398可以抑制结肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、等恶性肿瘤的生长，诱导其凋亡［6］，毕建斌等［7］研究NS398通过前列腺素E2诱导肾癌细胞的凋亡与该研究结果类似，该研究过程中仔细观察了浓度不同的NS398抑制COX-2后会直接影响细胞生物学特点，给其增殖以及凋亡造成很大影响。李尧等［8］用MTT方法研究NS398对唾液腺腺样囊性癌（SACC）-83细胞抑制作用结果基本一致，该实验研究利用MTT检测能够发现NS398的浓度不同，会通过时间以及剂量等一些依赖性的方式来对SCG7901细胞增殖造成抑制，通过研究统计学可以发现，效果最明显的时间是在72 h，抑制率达到了70.32%。200 μmol/L 的NS398作用于SCG7901细胞后DNA电泳图也可以发现其特征性梯形图谱比较明显。通过相关对比和研究可以发现，延长条带也会更明显，并且在72 h时，其亮度最高。通过流式细胞仪来对细胞凋亡的情况进行检查，可以发现，NS398的浓度在作用细胞24 h之内时，依赖性较强，并且随着作用浓度的增加，凋亡率也会有一定提高（F=12.414，P＜0.01）。所以，可以说NS398对体外的癌细胞有着明显抑制作用，抑制时存在明显浓度依赖和时间依赖，这与双金全在NS398对SGC7901胃癌细胞生长及CD44V6、MMP-9基因表达的影响中基本一致。此外，将NS398作用在SCG7901细胞24 h后，细胞周期也会发生变化：0、50、100、150、200 umol/LNS398对SCG7901细胞处理24 h之后，主要是G1/G0期的百分率增加，而在G2/M以及S期中，百分率的降低比较明显，并且，在G2时期，细胞分化也出现了停滞不前的情况，也就是其作用在细胞周期的S/G2点，NS398对SCG7901细胞周期造成的干预作用表现在抑制细胞DNA合成的后期；并且引起周期阻滞的效应在24 h呈现剂量依赖性（F=21.315，P＜0.01）。但毕建斌等［7］研究NS398通过前列腺素E2诱导肾癌细胞的凋亡研究结果为NS398作用肾癌786-0细胞24 h后，在细胞周期G0/G1期前出现明显的亚二倍体凋亡峰，随着浓度升高，凋亡峰亦越来越增高。对照组及NS398在50、100、200 μmol/L时，细胞凋亡率分别（2.60±0.98）%、（6.13±2.63）%、（8.26±3.91）%、（21.88±2.62）%。实验组与培养时间相同的对照组的细胞凋亡率比较差异有统计学意义（P＜0.05），这与该研究不一致，具体细节有待进一步研究，有关COX-2与胃癌关系的研究报道很多，表现COX-2在胃癌中强表达，且与胃癌的恶性生物学特性正相关，与预后呈负相关，而通过实验可以发现，NS398能够对体外的SCG7901细胞造成抑制作用，并对其增殖造成影响，促使其凋亡，导致其周期停滞不前。

由此，可以说在胃癌治疗中，COX-2是新靶基因，对其造成的抑制作用比较出色，并且其副反应比较小，所以，有必要将其运用到临床癌症治疗中去，应用前景比较广阔。

［参考文献］

［1］Joo YE，Rew JS，SeoYH，et al Cyclo-oxygenase-2 over expression correlates with vascular endothelial growth factor expression and tumor angiogenesis in gastric cancer［J］.J Clin Gastroent，2013，37（1）：28-33.

［2］LeungWK，ToKF，GoMY，et al. Cyclo-oxygenase-2 up regulates vascular endothelial growth factor expression and angiogenesis in human gastric carcinoma［J］.Int J Oncol，2013，23（5）：1317-1322.

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［4］王纯雁，王敏，王欣彦，等.NS39对卵巢癌细胞系CA0V3 和OVCAR3生长抑制作用的研究［J］.中华妇产科杂志，2015，38（7）：415.

［5］Yu Q，I Stamenkovic.Localization of matrix metalloproteinase 9 to the cell surface provides a mechanism for CD44-mediated tumor invasion［J］.Genes Dev，2010，13（1）：35.

［6］产松苗，欧希龙，孙为豪.NS-398对人胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响［J］.江苏医药，2012（17）：2000.

［7］毕建斌.COX-2抑制剂NS398通过抑制前列腺素E2诱导肾癌细胞的凋亡［J］.中国医科大学学报，2012，36（5）：587-589.

［8］李尧.NS398对SACC-83细胞抑制作用实验研究［J］.中国实用口腔科杂志，2015（3）：85-87.

Effect of Non-steroid Anti-inflammatory Drug NS398 on Gastric Cancer Line SCG7901

FAM Zhan-bin
Department of General Surgery，Longyao County Hospital，Longyao，Hebei Province，055350 China

［Abstract］Objective To discuss the effect of selective cox inhibitor NS398 on the biological behavior of gastric cancer line SCG7901. Methods The suppress proliferation and promoting apoptosis functions of NS398 on the gastric cancer line SCG7901 was researched by MTT and DNA gradient degradation testing and flow cytometry method in the laboratory of the second hospital of Hebei medical university from June 2014 to December 2014. Results NS398 had an obvious growth inhibition effect on the gastric cancer line SCG7901 and the manifestation was dose-dependent，（F=35.984，P＜0.01），and the DNA gradient degradation testing and flow cytometry analyzed that the NS398 concentration dependently induced apoptosis of gastric cancer line SCG7901，（F=12.414，P＜0.01），and apoptosis was correlated with the cell cycle arrest（F=21.315，P＜0.01）and the main arrest was in S/G2 stage. Conclusion NS398 has an obvious effect of in vitro growth inhibition，inducing apoptosis and blocking DNA synthesis in a concentration-dependent manner on gastric cancer line SCG7901.

［Key words］Cyclooxygenase-2；Non-steroid anti-inflammatory drug NS398；Gastric cancer line SCG7901

［中图分类号］R735.2

［文献标识码］A

［文章编号］1674-0742（2016）04（c）-0014-04

［作者简介］范占彬（1977-），男，河北隆尧人，硕士，副主任医师，主要从事胃肠外科方面研究。

收稿日期：（2016-01-25）