ICP-MS用于云南南部四种特色蜂蜜的植物源鉴别分析

魏 月, 陈 芳, 王 勇，陈兰珍，张学文，王艳辉，吴黎明*，周 群

1. 中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093 2. 农业部蜂产品质量安全风险评估实验室，北京 100093 3. 云南省农业科学院，云南 昆明 650231 4. 清华大学化学系，北京 100084

ICP-MS用于云南南部四种特色蜂蜜的植物源鉴别分析

魏 月1, 2, 陈 芳1, 2, 王 勇1, 2，陈兰珍1, 2，张学文3，王艳辉3，吴黎明1, 2*，周 群4*

1. 中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093 2. 农业部蜂产品质量安全风险评估实验室，北京 100093 3. 云南省农业科学院，云南 昆明 650231 4. 清华大学化学系，北京 100084

采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)技术结合化学计量学分析技术对采自云南南部的四种特色蜂蜜中的23种矿物元素进行了分析。结果表明：ICP-MS技术测定蜂蜜中多种矿物元素含量的稳定性、精确度较好，回收率较高；23种矿物元素中有21种元素(Na，Mg，K，Ca，V，Cr，Mn，Fe，Co，Ni，Cu，Zn，As，Se，Sr，Mo，Cd，Sb，Ba，Tl，Pb)在不同蜂蜜品种间存在显著差异；主成分分析结果显示，前4个主成分的累积方差贡献率达到77.74%，第一主成分中的Mg，Ca，Mn，Co，Sr，Cd，Ba 七种元素包含大部分蜂蜜信息；通过逐步判别分析，Mg, K, Ca, Cr, Mn, Sr, Pb共七种元素被筛选出来并用于建立判别函数模型，对所建模型进行回代检验和交叉检验，正确判别率分别为90%和86.7%，表明多元素指标对云南南部四种特色蜂蜜植物源的判别效果较好。鉴于所采蜂蜜样品都来自云南南部，气候和土壤等环境条件类似，四种蜂蜜中矿质元素的差异主要与对应的蜜源植物有关，因此，利用矿质元素差异鉴别蜂蜜植物源具有可行性。

云南；蜂蜜；植物源；ICP-MS；化学计量学

引 言

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜物质[1]，其主要成分包括葡萄糖、果糖、水分，还包括氨基酸、维生素等多种活性物质及多种矿物质等[2]。蜂蜜中含有Fe，Cu，K，Na，Ca，Mg，Mn，Al，Si，Cr，Pt，Ni等多种微量元素，其重要来源是植物的花蜜，因此蜂蜜中元素含量很可能反映出相应蜜源植物或者地理环境的信息。随着原产地保护、地理标识和传统特色保护制度的完善以及名牌蜂蜜战略的建立，蜂蜜植物源溯源技术和地理来源溯源技术发挥着同等并且重要的作用。因此，研究矿质元素是否与蜂蜜植物源具有相关性具有积极的意义。

常见的微量元素分析方法包括火焰原子吸收光谱(FAAS)[3-5]、石墨炉原子吸收光谱(GFAAS)[6-7]、电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)[8-10]和电感耦合等离子质谱(ICP-MS)[11-13]等。目前，ICP-MS因其在测量蜂蜜中痕量元素含量方面具有较高的灵敏度和准确性而被广泛应用[14]，ICP-MS不仅具有可以同时分析几十种矿物元素、检出限低、线性范围宽等特点，还能提供更简单的光谱信息和同位素信息[15]。

本研究采用湿法消解-ICP-MS技术，结合化学计量学方法中的单因素方差分析、主成分分析和判别分析方法，分析了采自云南南部的四种特色蜜种，包括红河苕子蜜、蒙自石榴蜜、景洪橡胶蜜和普洱咖啡蜜共60个蜂蜜样品中23种矿物元素的种类和含量特征。考虑到环境因素(土壤、水质等)也会使蜂蜜中矿质元素种类和含量产生差异，本实验样品采集过程中尽量选择具有类似环境条件的蜂场取样，减少环境因素对试验的影响。研究结果不仅对判别云南地区特种蜂蜜植物源和地理标志产品特性分析具有重大意义，还将为其他蜂蜜的植物源鉴别提供技术支持及理论依据，为打击蜂蜜以次充好、保护贸易公平提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

电感耦合等离子质谱仪：美国Agilent 7500cx ICP-MS，微流雾化器，镍采样锥和截取锥；石墨消解仪；Milli-Q 超纯水系统(美国，Milestone公司)。

实验所用有机试剂均为优级纯，实验用水均为超纯水：硝酸(德国，Sigma-aldrich)；超纯水(11.8 MΩ·cm)。

内标溶液：Se(c=1 000 mg·L-1)，Ge(c=1 000 mg·L-1)，Rh(c=1 000 mg·L-1)，Zn(c=1 000 mg·L-1)，Tb(c=1 000 mg·L-1)，Bi(c=1 000 mg·L-1)，Re(c=1 000 mg·L-1)；用5% HNO3配制成1 mg·L-1的混合内标溶液。

元素单标：Na(c=1 000 mg·L-1)，Mg(c=1 000 mg·L-1)，K(c=1 000 mg·L-1)，Ca(c=1 000 mg·L-1)，Cr(c=1 000 mg·L-1)，Pb(c=1 000 mg·L-1)。调谐液：Li, Mg, Y, Ce, TL, Co(c=1 μg·L-1)，Agilent公司。

1.2 样品处理

准确称量蜂蜜样品1.0 000 g，置于50 mL聚四氟乙烯消化管中，加入优级纯硝酸10 mL，随同试样做试剂空白、平行样，放置过夜。次日，将其放入石墨消解仪中，设置初始温度为70 ℃，保持30 min，20 min升至160 ℃，保持2 h，然后10 min升至200 ℃，开始排酸。保持较长的中高温区消解时间是为了彻底分解蜂蜜。

在消解的过程中，为使样品消解均匀，经常移动消化管的位置。当消化管中的液体仅剩约1 mL时，取出溶样管，自然冷却至室温，用超纯水定容到50 mL。过孔径为0.22 μm PES聚醚砜膜后，上机分析。

1.3 仪器工作参数

仪器工作参数见表1。

1.4 数据处理

用SPSS 21.0软件对测定数据进行方差分析、多重比较分析、主成分分析和判别分析。

2 结果与讨论

2.1 样品的消解

测定蜂蜜中微量元素首先必须对样品进行消解，常用消解方法包括湿法消解法、高温灰化法和微波消解法。其中湿法消解相对于其他两种方法更适合于大批量样品的处理，平行样品之间结果稳定，能避免因温度过高(如高温灰化法)而造成的样品中挥发性元素的损失。因此，本试验采用湿法消解技术处理蜂蜜样品。又因为蜂蜜的主要成分是糖类，经试验发现仅用10 mL的硝酸体系就可以实现对蜂蜜的完全消解。

2.2 工作曲线和检出限

用2% HNO3介质配制0.05，0.1，0.5，1.0，5.0，10.0 μg·mL-1不同浓度梯度的混合元素标准溶液，以2%HNO3作为空白试剂并建立标准曲线，用各待测元素与内标元素计数值的比值与各元素浓度进行线性回归分析。结果表明，各待测元素线性关系良好，线性相关系数均不低于0.993 8(表2)。在此试验条件下，对试剂空白溶液进行10次重复测定，标准偏差的3倍所对应的元素浓度值即为方法检出限，各待测元素的检出限同见表2。

Table 1 Operating conditions of ICP-MS and data acquisition parameters

Table 2 Relative parameters of standard curve and the limits of detection

续表2

Sr0.0～10.0Y=3.970X+8.545×10-10.99990.018Mo0.0～10.0Y=1.376X+3.818×10-10.99980.495Ag0.0～10.0Y=1.256×102X+1.814×100.99380.001Cd0.0～10.0Y=3.915X+4.857×10-21.00000.001Sb0.0～10.0Y=3.362X+1.361×1021.00000.051Ba0.0～10.0Y=1.662X+4.928×10-11.00000.238Tl0.0～10.0Y=1.102×10X+2.288×10-10.99990.001Pb0.0～10.0Y=7.535X+2.5070.99990.064U0.0～10.0Y=3.338×10X+1.0961.00000.081

2.3 方法的稳定性和精密度

选择具有代表性的Na，Mg，K，Ca 四种元素和Cr和Pb两种微量元素进行加标回收实验。Na, Mg, K, Ca的加标浓度10.0和50.0 μg·mL-1，Cr和Pb的加标浓度50.0和100.0 ng·mL-1，每个加标浓度做六个平行。测得样品的加标回收率在94.6%～103.0%之间，相对标准偏差在0.9%～3.2%之间，结果表明本试验方法的稳定性和精密度较好(表3)。

Table 3 Standard addition recoveries and relative standard deviation of the sample(n=6)

2.4 数据处理

2.4.1 不同品种云南蜂蜜元素含量差异分析

分别测定采自云南南部的四种特色蜜种，苕子蜜、石榴蜜、橡胶蜜和咖啡蜜各15个样品的23种元素含量，并进行方差分析，结果列于表4。方差分析结果表明，在不同蜂蜜品种间，Na，Mg，Ca，K，V，Cr，Mn，Fe，Co，Ni，Cu，Zn，As，Se，Sr，Cd，Sb，Ba，Tl，Pb共20种元素含量差异极显著(p<0.01), Mo元素含量差异显著(p<0.05)，Ag和U两种元素含量差异不显著(p>0.05)；多重比较结果表明：四种蜂蜜中，除Na，Mg，Ca，K，Fe五种元素的平均含量较高之外，微量元素Cr，Mn，Ni，Cu，Zn，Ba等元素的平均含量也相对较高。其中苕子蜜中Na，Ni，Zn，As，Mo的平均含量显著高于其他三个蜜种；橡胶蜜和咖啡蜜中K，Mg，Ba的平均含量较高，而橡胶蜜的Mn和Sr平均含量也相对较高；石榴蜜中除Pb和Sb的平均含量较高之外，其他元素含量均处于相对较低或中等水平。由此可见，同一地区不同植物源蜂蜜间元素含量具有各自的特征。

Table 4 21 elements of content of four kinds of honey in Yunnan province

续表3

蜂蜜品种CoNiCuZn苕子蜜3.47Bb±0.7796.14Aa±90.66127.65ABb±54.542221.77Aa±525.30石榴蜜1.69Cc±1.1224.07ABb±23.15101.56Bb±24.191507.57ABab±1015.34橡胶蜜11.27Aa±2.4114.03ABbc±24.8981.44Bb±86.81872.82Bb±306.15咖啡蜜10.22Aa±1.571.69Bc±3.56213.28Aa±94.09892.87Bb±442.94蜂蜜品种AsSeSrMo苕子蜜40.15Aa±17.612.09Bb±2.8611.76Bb±1.3829.45Aa±13.36石榴蜜32.12ABac±26.574.50ABa±2.243.44Cc±2.2223.38ABab±27.23橡胶蜜10.03Bb±14.834.24ABab±3.5248.60Aa±23.837.12Bb±8.68咖啡蜜14.58Bbc±20.976.31Aa±3.1417.06BCbc±23.6720.87ABab±19.10蜂蜜品种CdSbBaTlPb苕子蜜0.00Cc±0.002.61ACb±0.8950.08Ac±16.050.40Aa±0.2126.65Bb±8.81石榴蜜0.70Bb±0.674.83Aa±2.5621.59Bb±24.830.13ABb±0.2340.29Aa±18.57橡胶蜜2.69Aa±1.431.92BCbc±1.49106.42Aa±69.800.00Bb±0.0012.16Cc±7.80咖啡蜜1.09ABCbc±1.581.26Bc±0.6290.41Aac±66.400.00Bb±0.0010.08Cc±10.46

注：表格中的数值表示形式为平均值±标准差；Na，Mg，K，Ca，Fe的单位是μg·g-1，其他元素的单位是ng·g-1；右上角标注的大写字母表示差异极显著(p<0.01)，小写字母表示差异显著(p<0.05)。

2.4.2 不同品种蜂蜜差异元素的主成分分析

对四种特色蜂蜜品种间存在显著差异的21种元素进行主成分分析。结果表明，前4个因子特征值大于1，其累积方差贡献率达到77.74%，说明前4个公因子基本包含了全部变量的主要信息(表5)。在表5中，经旋转后大于0.5的数表示在第一主成分上Mg，Ca，Mn，Co，Sr，Cd，Ba这七种元素具有较高载荷，说明第一主成分基本反映了这些元素的信息，方差贡献率占30.53%；同理，第二主成分主要综合了Na，V，Cr，Zn，As，Mo，Tl，Pb八种元素的信息，方差贡献率是23.78%；第三主成分主要综合了K, Fe, Cu,三种元素含量的信息，方差贡献率占13.90%；第五主成分主要综合了K和Se元素含量的信息，方差贡献率占9.52%。由此可见，Na, V, Cr, Zn, As, Mo, Tl, Pb, K, Fe, Cu, Se12种元素综合了云南南部地区苕子蜜、石榴蜜、橡胶蜜和咖啡蜜中特征元素的主要信息，说明利用ICP-MS多元素分析技术对蜂蜜品种进行溯源是有可能实现的。

Table 5 Loading value and cumulative contribution of variance for the four principal components

2.4.3 依据蜂蜜元素含量对其品种的判别分析

为进一步分析蜂蜜中元素特征和蜂蜜品种之间的相关性，本实验对21种含量差异显著的元素进行了逐步判别分析，筛选出对蜂蜜品种判别有效的变量，建立数学判别模型。分析结果表明，Mg，K，Ca，Cr，Mn，Sr，Pb七种元素被筛选出来并用于建立判别函数模型。其线性判别方程系数见表6。

Table 6 Fisher’s linear discriminant functions coefficients

用所建立的模型进行回代检验和交叉验证，其判别结果见表7。回代检验结果表明，60个蜂蜜样品有品种6个被判错，整体的正确判别率为90%。交互判别中有8个被判错，整体判别正确率为86.7%，表明多种元素含量对蜂蜜品种的判别有较好的判别效果。图1是典型判别函数的散点图，从该图可以直观的看出，不同品种的蜂蜜中元素的分布具有随品种集中的趋势，并且，苕子和石榴两种蜂蜜可以被完全地区别开，而橡胶蜜和石榴蜜组的质心距离很近，因此导致判别率偏低。

Table 7 Classification results of discrimination analysis

Fig.1 Canonical discriminant function score plot

3 结 论

建立了利用湿法消解-ICP-MS分析蜂蜜中的23种矿物元素含量的方法，方法的稳定性和精密度良好，回收率较高。结合化学计量学分析了云南南部四种特色蜂蜜的矿物质特征与植物来源的相关性，方差结果表明，不同植物源蜂蜜的Na，Mg，K，Ca，V，Cr，Mn，Fe，Co，Ni，Cu，Zn，As，Se，Sr，Mo，Cd，Sb，Ba，Tl，Pb 21种矿物元素含量差异显著。对存在显著差异的21种元素进行主成分分析，发现前4个主成份的累积方差贡献率达到77.74%，第一主成份中的Mg，Ca，Mn，Co，Sr，Cd，Ba七种元素特征包含大部分蜂蜜信息，是对蜂蜜植物源最好的预测。采用逐步判别分析法进一步分析表明，Mg，K，Ca，Cr，Mn，Sr，Pb七种元素被筛选出来并用于建立判别函数模型，对所建模型进行回代检验和交叉检验，正确判别率分别为90%和86.7%，表明多种元素指标对蜂蜜植物源的判别效果较好。

由于本试验设计过程中充分考虑并尽量减少了环境因素对蜂蜜中矿质元素种类和含量的影响，试验结果中矿质元素差异更大程度上是因蜂蜜植物源差异引起的。因此，研究结果不仅对判别云南地区特种蜂蜜植物源和具有云南特色地理标志产品的特性分析具有重大意义，还将为其他蜂蜜的植物源鉴别提供技术支持及理论依据，为打击蜂蜜以次充好、保护贸易公平提供技术支撑。

[1] The State Standard of the People’s Republic of China—Honey GB14963—2011(中华人民共和国标准—蜂蜜 GB14963—2011). Beijing: China Standard Press(北京：中国标准出版社)，2011. 1.

[2] Ezzel-Arab A M, Girgis M, Hegazy E M, et al. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2006, 6(1): 6.

[3] Tuzen M, Silici S, Mendil D, et al. Food Chemistry, 2007, 103(2): 325.

[4] Madejczyk M, Baralkiewicz D. Analytical Chemistry Acta, 2008, 617(1-2): 11.

[5] Grembecka M, Szefer P. Environment Monitor Assess, 2013, 185(5): 4033.

[6] Ajtony Z, Bencs L, Haraszi R, et al. Talanta, 2007, 71(2): 683.

[7] Sahan D, Barbosa F, Tomazelli A C, et al. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2002, 373(3): 183.

[8] Kira C S, Maihara V A. Food Chemistry, 2007, 100(1): 390.

[9] Pisani A, Protano S, Riccobono F, et al. Food Chemistry, 2008, 107(4): 1553.

[10] Mehment M, Fahad Y, AL Juhaimi. Environment Monitor Assess, 2012, 184(4): 2373.

[11] Chudzinska M, Baralkiewicz D. Food Chemistry Toxicol, 2010, 48(1): 284.

[12] Ana B P L, Silmara R B, Renato L, et al. Food Analytical Methods, 2014, 7(5): 1009.

[13] Sahan Y, Barbosa F, Gucer S, et al. Food Chemistry, 2007, 105(1): 395.

[14] Marua C, Danuta B. Food and Chemical Toxicology, 2011, 49(11): 2742.

[15] Batista B L, da Silva L R S, Rocha B A, et al. Food Research International, 2012, 49(1): 210.

*Corresponding authors

Application of ICP-MS to Identify the Botanic Source of Characteristic Honey in South Yunnan

WEI Yue1, 2, CHEN Fang1, 2, WANG Yong1, 2, CHEN Lan-zhen1, 2, ZHANG Xue-wen3, WANG Yan-hui3, WU Li-ming1, 2*, ZHOU Qun4*

1. Institute of Apiculture Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China

2. Risk Assessment Laboratory for Bee Products Quality and Safety of Ministry of Agriculture (Beijing), Beijing 100093, China

3. Yunnan Province Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650231, China

4. Department of Chemistry, Tsinghua University, Beijing 100084, China

By adopting inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) combined with chemometric analysis technology, 23 kinds of minerals in four kinds of characteristic honey derived from Yunnan province were analyzed. The result showed that 21 kinds of mineral elements, namely Na, Mg, K, Ca, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, As, Se, Sr, Mo, Cd, Sb, Ba, Tl and Pb, have significant differences among different varieties of honey. The results of principal component analysis (PCA) showed that the cumulative variance contribution rate of the first four main components reached 77.74%, seven kinds of elements (Mg, Ca, Mn, Co, Sr, Cd, Ba) from the first main component contained most of the honey information. Through the stepwise discriminant analysis, seven kinds of elements (Mg, K, Ca, Cr, Mn, Sr, Pb) were filtered out and used to establish the discriminant function model, and the correct classification rates of the proposed model reached 90% and 86.7%, respectively, which showed elements contents could be effectively indicators to discriminate the four kinds characteristic honey in southern Yunnan Province. In view of all the honey samples were harvested from apiaries located at south Yunnan Province where have similar climate, soil and other environment conditions, the differences of the mineral elements contents for the honey samples mainly due to their corresponding nectariferous plant. Therefore, it is feasible to identify honey botanical source through the differences of mineral elements.

Yunnan; Honey; Botanical source; ICP-MS; Chemometric

Aug. 19, 2014; accepted Dec. 16, 2014)

2014-08-19，

2014-12-16

国家自然科学基金项目(31172274，31372385)，现代蜂产业技术体系(CARS45)和公益性行业(农业)专项项目(201203046)资助

魏 月，女，1989年生，中国农业科学院蜜蜂研究所硕士研究生 e-mail: weiyueyueyue@sina.com *通讯联系人 e-mail: apiswu@126.com; zhouqun@mail.tsinghua.edu.cn

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)01-0262-06