骨保护素/核因子κB受体活化因子配体在甲状旁腺激素调控下颌骨牵张成骨中的表达效应

李永頔　朱鹏娜　王冬香　陈嘉民　唐正龙贵州医科大学附属医院口腔颌面外科，贵阳 550004



骨保护素/核因子κB受体活化因子配体在甲状旁腺激素调控下颌骨牵张成骨中的表达效应

李永頔朱鹏娜王冬香陈嘉民唐正龙
贵州医科大学附属医院口腔颌面外科，贵阳 550004

[摘要]目的研究甲状旁腺激素（PTH）调控下颌骨牵张成骨中骨保护素（OPG）和核因子κB受体活化因子配体（RANKL）的表达，探讨PTH促进牵张成骨的作用机制。方法建立兔下颌骨牵张成骨模型，随机分为实验组和对照组。实验组隔日皮下注射不同剂量PTH，对照组隔日皮下注射生理盐水。酶联免疫吸附法检测血清中OPG的水平，免疫组织化学法研究OPG、RANKL在下颌骨牵张成骨新骨中的表达。结果在牵张期血清OPG水平逐渐升高；在牵张结束时，实验组OPG表达最强，与对照组比较差异有统计学意义。随固定期的延长，OPG的表达逐渐下降，而RANKL的表达逐渐增强。结论间隙性皮下注射PTH可上调OPG表达，加速骨代谢，促进下颌骨牵张区新骨生成。

[关键词]甲状旁腺激素； 牵张成骨； 核因子κB受体活化因子配体

Supported by: The National Natural Science Foundation of China(81160130).Correspondence: Tang Zhenglong, E-mail: zhenglongtang@hotmail.com.

牵张成骨（distraction osteogenesis，DO）是通过对切开后的骨段施加特定大小的牵引或扩张力，使骨段间隙内再生新骨以延长或扩宽骨骼，达到矫治骨发育不足或修复骨缺损的一种外科技术。而如何提高牵张成骨新骨生成速度一直是该领域的热门研究课题。新骨的形成和代谢受多种因素的调节，包括激素及其受体、细胞因子等。甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）是甲状旁腺主细胞分泌的维持机体内钙磷代谢平衡的一种重要的调钙激素，能够调节骨骼的合成代谢和分解代谢过程。研究[1-2]发现PTH影响骨骼代谢主要依赖于PTH给予剂量和方式，持续高剂量的给予PTH能增加骨吸收，而间歇性小剂量应用PTH具有成骨效能。PTH可促进牵张成骨新骨生成[3-5]，但目前尚未见应用不同剂量PTH促进颌骨牵张成骨分子机制研究的文献报道。在骨改建过程中，骨保护素（osteoprotegerin，OPG）和核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）为关键调控分子，OPG/RANKL在牵张成骨新骨生成过程中起重要调控作用[6]。本实验通过建立兔下颌骨牵张成骨实验动物模型，在牵张过程中给予不同剂量PTH，检测牵张成骨过程中OPG和RANKL的表达，为PTH促进下颌骨牵张成骨调控机制提供理论依据。

1　材料和方法

1.1实验动物

选用贵州医科大学实验动物中心提供的SPF级新西兰大耳白兔45只，5个月龄，质量（2.5±0.2） kg，雌雄不限。

1.2主要试剂和材料

OPG、RANKL即用型免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），rhPTH（1-34）（Tocris公司，英国），兔专用下颌牵张器（宁波慈北医疗器械有限公司）。

1.3分组

将实验动物随机分成实验组（A、B、C、D组）和对照组，每组9只。对照组颈部隔日皮下注射生理盐水1 mL，A、B、C、D组隔日皮下注射10、 20、30、40 μg·kg-1rhPTH（1-34），给药至动物处死。

1.4建立兔下颌牵张成骨模型

3%戊巴比妥钠给予动物耳缘静脉麻醉，术区消毒。随机选取一侧下颌骨行牵张成骨术。在下颌骨下缘作切口，长2.5 cm。切开皮肤、皮下组织、肌肉及筋膜，翻瓣，暴露下颌骨外侧面，于第一磨牙和颏孔间作下颌骨垂直截骨，安放牵张器（图1）。经5 d延迟期后牵引延长下颌骨。牵张速率为1 mm·d-1，每次0.5 mm，每日2次，牵张10 d后固定2周。

1.5酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosor-bent assay，ELISA）检测血清OPG水平变化

于牵张第3天、第8天及牵张结束、固定1周和2周时于耳缘静脉采血2 mL，分离血清后冻存备检血清OPG水平。

1.6新骨组织标本获取与处理

各组实验动物于牵张结束时、固定1周、固定2周时处死3只实验动物，取牵张区新生骨标本用4%多聚甲醛溶液固定48 h，20%乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）脱钙，乙醇逐级脱水，石蜡包埋，沿牵张方向做5 μm厚连续切片。

图1　放置颌骨牵张器Fig 1　Placed the distractor

1.7免疫组织化学方法检测OPG和RANKL的表达

用免疫组织化学SABC法检测牵张区新生骨组织中OPG和RANKL的表达。利用HMIAS图像分析系统作阳性细胞积分光密度值（integral optical density，IOD）测定，在100倍视野下每张切片选择5处相同面积（200 μm×200 μm）的阳性细胞最密集处进行测定，取其平均值为该切片阳性细胞的IOD。

1.8统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件对实验数据进行单因素方差分析，P＜0.05时差异有统计学意义。

2　结果

2.1血清中OPG的水平变化

各组血清中OPG随牵张期时间的延长逐渐升高，到牵张10 d时达到最高值，之后随固定期的延长逐渐下降。到固定2周时，各组仍高于术前基础值。在牵张3 d、牵张8 d、固定2周时，B、C、D组与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）；在牵张10 d时，各实验组与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）；在固定1周时，C、D组与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。C组血清OPG水平最高，但与其他实验组比较差异无统计学意义（表1）。

2.2OPG在牵张区新骨中的表达

牵张10 d时，OPG在牵张区的梭形细胞和邻近成熟骨的髓腔中呈阳性表达，在新生骨小梁的骨细胞和周围的成骨细胞也呈阳性表达（图2）。固定1周时，各组的阳性表达都较牵张10 d时有所减弱，OPG在梭形细胞和成骨细胞中的表达强度减弱，但在骨细胞和骨髓腔中OPG表达仍较强。固定2周时，OPG在梭形细胞和成骨细胞中的表达强度更弱，但各组OPG在骨细胞和骨髓腔中仍呈阳性表达。

表1　牵张成骨不同时期血清OPG的水平变化Tab 1　The serum levels of OPG in different period of DO　ng·L-1, n=3,±s

表1　牵张成骨不同时期血清OPG的水平变化Tab 1　The serum levels of OPG in different period of DO　ng·L-1, n=3,±s

注：#表示同时期与对照组比较，P<0.05。

组别　　基础值　　牵张3 d　　牵张8 d　　牵张10 d　　固定1周　　固定2周对照组　880.63±16.50　909.38±16.50　960.63±15.46　1 037.00±2.47　1 005.00±12.37　934.50±1.06 A组　896.25±17.26　930.54±16.81　982.68±17.37　1 070.42±17.02#　1 021.25 ±16.39 　936.75±1.41 B组　896.88±23.22　941.88±24.36#1 002.50±22.03#1 077.00±2.47#1 033.75±10.61　946.50±1.06#C组　895.42±17.56　967.92±16.65#1 072.92±15.07#　1 212.25±15.56#　1 125.00±1.77#　967.50±1.77#D组　888.75±12.50　947.92±12.58#1 017.92±10.10#　1 121.75±9.90#1 060.75±11.31#　950.50±4.60#

图2　牵张10 d时牵张区新骨组织中OPG的表达　SABC　× 400Fig 2　The expression of OPG in the new bone tissue of distraction gap at the 10th day after DO　SABC　× 400

染色强度IOD测定结果显示：牵张10 d时，B、C、D组染色强度高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。固定1周时， C、D组的阳性染色强度与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。固定2周时，各实验组与对照组比较差异无统计学意义。C组染色强度最高，但与其他实验组间比较差异无统计学意义（表2）。

2.3RANKL在牵张区新骨中的表达

下颌牵张延长结束时，RANKL与OPG的表达部位基本相同，但其阳性表达强度与OPG相反，其阳性表达较弱。固定1周时，RANKL的阳性表达强度较牵张10 d时有所增强。实验组和对照组在骨细胞和骨髓腔中呈阳性表达。固定2周时，RANKL的阳性染色更强，实验组和对照组在骨细胞和骨髓腔中阳性表达均较强（图3）。

表2　不同时期牵张区新骨中OPG的表达Tab 2　The expression of OPG in the new bone tissue of distraction gap in each period

图3　固定2周时牵张区新骨组织中RANKL的表达SABC×400Fig 3　The expression of RANKL in new bone tissue of distraction gap at the 2nd week consolidation SABC　×400

染色强度IOD测定结果显示：下颌牵张延长结束时，实验组较对照组的阳性染色强度弱，差异有统计学意义（P<0.05）。固定1周时， B、C、D组的阳性染色弱于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。固定2周时， C、D组的阳性染色强度高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）（表3）。

表3　不同时期牵张区新骨组织RANKL的表达Tab 3 The expressions of RANKL in new bone tissue of distraction gap in each period

3　讨论

PTH是重要的钙平衡调节激素，对骨代谢具有双重调节作用，既促进骨形成又促进骨吸收。研究[7]发现间歇性地补充外源PTH可以增强新生小鼠骨骼中间充质细胞向成骨细胞的分化、 定向增生，同时可抑制成骨细胞谱系的凋亡，而成骨细胞与破骨细胞之间相互作用是骨重塑的关键，破骨细胞是PTH发挥局部作用的重要靶细胞，在骨重建过程中，OPG 和RANKL为其关键调控分子[8]。RANKL与破骨细胞前体表面结合，刺激破骨细胞前体的增殖，相互融合成多核的破骨细胞。而OPG作为一种可溶的诱饵受体，能与RANKL竞争性结合，从而阻断RANKL/ RANK信号通路，抑制破骨细胞的激活、分化、成熟和吸收功能，还可能诱导破骨细胞凋亡[9]。RANKL表达增加，可导致破骨细胞分化、激活和成熟，从而导致骨吸收活动增强。OPG作为诱导受体与RANK结合，竞争性抑制RANKL与RANK间信号传递，具有抑制RANKL诱导破骨细胞发生的能力，从而抑制破骨细胞的分化、激活和成熟，抑制骨吸收，促进骨形成[6]。研究[10]认为OPG是牵张成骨的重要调节剂，可以促进新骨的形成。Tang等[11]研究发现PTH可促进下颌骨牵张成骨新骨生成，增加牵张区新骨骨密度。本实验研究发现，OPG主要定位于新骨组织中的成纤维细胞及增殖活跃的成骨细胞。在牵张中、末期和固定期1周组织中，OPG表达水平都较高；随着固定期的延长，新生骨逐渐成熟，大量成骨细胞被埋入钙化的骨基质中，OPG表达水平下降，在成骨细胞中只有微弱表达。在牵张结束时，实验组OPG表达最强，且与对照组比较差异有统计学意义。而RANKL在固定期表达逐渐增强，在固定2周时，RANKL的阳性染色更强。在新骨生成过程中，RANKL/OPG是调控新骨生成的一个重要杠杆。本实验中RANKL/OPG的值是不断变化的，随着牵张期的结束成骨细胞的分化成熟，OPG的阳性表达下降，而RANKL的阳性表达上升，表明新骨成熟期OPG的合成和分泌减少，抑制破骨细胞分化的作用也减弱，从而使得RANKL的表达水平上升，最后失去对破骨细胞的促分化和激活作用，从而使骨吸收和骨形成达到平衡。

不同剂量PTH促进牵张成骨新骨生成质量存在一定差异，但目前关于促进牵张成骨新骨生成的适宜PTH剂量尚不清楚。Aleksyniene等[12-14]研究显示每天使用25 µg·kg-1和5 µg·kg-1两种剂量PTH均可提高兔胫骨牵张区新骨矿化程度，但同时发现25 µg·kg-1皮下注射对新骨的矿化程度更有效。Ali等[4]通过建立大鼠下颌牵张成骨模型，每周3次皮下注射60 μg·kg-1PTH，结果显示应用PTH组牵张区新骨平均骨容量大于对照组。本研究发现，各实验组血清OPG水平和新骨中OPG表达强度存在差异，在牵张早期，C组的OPG表达最高，RANKL表达最低，提示在下颌骨牵张成骨过程中，隔日皮下注射PTH 30 μg·kg-1能更有效地促进下颌骨牵张成骨新骨生成。

PTH与牵张应力同时作用于成骨细胞，新骨生成受牵张信号和PTH激素两方面的调控，这必然导致新骨生成的调控机制更复杂。外源性小剂量PTH间隙给予后，可能通过刺激骨髓微环境中成骨活性基因表达，或促进成骨细胞前体细胞的增殖分化，增加成骨细胞数量，延缓成骨细胞凋亡而延长其寿命，从而促进骨合成代谢，促进骨小梁和骨密质表面新骨沉积，增加骨的厚度和强度。据Tang等[15]研究发现小剂量间歇性皮下注射PTH（1-34）可通过增加成骨细胞数量、上调OPG表达而促进下颌骨缺损修复。本实验结果表明PTH可增加OPG在牵张期和固定早期表达，在新骨成熟期OPG的表达逐渐减低。OPG可能在PTH促进下颌牵张成骨的新骨生成过程中扮演十分重要的角色。

应用外源性PTH可以促进成骨细胞的增生，较好地提高下颌骨牵张成骨新骨的生成。其可能的作用机制是在牵张期及固定早期PTH可以增加OPG表达，抑制RANKL的表达，加速骨代谢及骨转换水平，从而促进下颌骨牵张区新骨的生成。但是对于PTH促进牵张成骨新骨生成的最适剂量、治疗持续时间、每天给药和周期性给药的比较等诸多问题仍需要进一步研究。

[参考文献]

[1]Dempster DW, Cosman F, Parisien M, et al.Anabolic actions of parathyroid hormone on bone[J].Endocr Rev, 1993, 14 (6):690-709.

[2]Chen H, Frankenburg EP, Goldstein SA, et al.Combination of local and systemic parathyroid hormone enhances bone regeneration[J].Clin Orthop Relat Res, 2003(416):291-302.

[3]Chan HL, McCauley LK.Parathyroid hormone applications in the craniofacial skeleton[J].J Dent Res, 2013, 92(1):18-25.

[4]Ali MN, Kobayashi T, Tanaka M, et al.Effects of intermittent parathyroid hormone treatment on new bone formation during distraction osteogenesis in the rat mandible[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol, 2012, 114(1):e36-e42.

[5]Ohata T, Maruno H, Ichimura S.Changes over time in callus formation caused by intermittently administering PTH in rabbit distraction osteogenesis models[J].J Orthop Surg Res, 2015, 10:88.

[6]Pérez-Sayáns M, Somoza-Martín JM, Barros-Angueira F, et al.RANK/RANKL/OPG role in distraction osteogenesis [J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 2010, 109(5):679-686.

[7]Sasaki M, Hasegawa T, Hongo H, et al.Bone histology after intermittent PTH treatment-animal models[J].Clin Calcium, 2013, 23(3):347-353.

[8]Boyle WJ, Simonet WS, Lacey DL.Osteoclast differentiation and activation[J].Nature, 2003, 423(6937):337-342.

[9]Honma M, Ikebuchi Y, Kariya Y, et al.Regulatory mechanisms of RANKL presentation to osteoclast precursors[J].Curr Osteoporos Rep, 2014, 12(1):115-120.

[10]葛巍立, 谢志坚, 何剑锋.兔下颌骨牵张成骨组织中c-fos 和OPG及OPGL的表达[J].浙江大学学报（医学版）, 2006, 35(5):496-500.Ge WL, Xie ZJ, He JF.Expression of c-fos, OPG, OPGL in rabbit mandibular distraction osteogenesis zone[J].J Zhejiang Univ (Med Sci), 2006, 35(5):496-500.

[11]Tang ZL, Bai S, Zhu PN, et al.An examination of differences in the new bone formation promoted by different doses of recombinant human parathyroid hormone during mandibular distraction osteogenesis[J].Plast Reconstr Surg, 2016, 137(2):347e-354e.

[12]Aleksyniene R, Eckardt H, Bundgaard K, et al.Effects of parathyroid hormone on newly regenerated bone during distraction osteogenesis in a rabbit tibial lengthening model.A pilot study[J].Medicina: Kaunas, 2006, 42(1):38-48.

[13]Aleksyniene R, Thomsen JS, Eckardt H, et al.Three-dimensional microstructural properties of regenerated mineralizing tissue after PTH (1-34) treatment in a rabbit tibial lengthening model[J].J Musculoskelet Neuronal Interact, 2009, 9(4):268-277.

[14]Aleksyniene R, Thomsen JS, Eckardt H, et al.Parathyroid hormone PTH(1-34) increases the volume, mineral content, and mechanical properties of regenerated mineralizing tissue after distraction osteogenesis in rabbits[J].Acta Orthop, 2009, 80(6):716-723.

[15]Tang ZL, Zhang WJ, Wang DX, et al.An experimental study addressing the promotion of mandibular defect repair through the intermittent subcutaneous injection of parathyroid hormone[J].J Oral Maxillofac Surg, 2014, 72(2):419-430.

（本文采编石冰）

Osteoprotegerin/receptor activator of nuclear factor-κB ligand expression in mandibular distraction osteogenesis regu-lated by parathyroid hormone

Li Yongdi, Zhu Pengna, Wang Dongxiang, Chen Jiamin, Tang Zhenglong.(Dept.of Oral and Maxillofacial Surgery, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China )

[Key words]parathyroid hormone;distraction osteogenesis;receptor activator of nuclear factor-κB ligand

[Abstract]Objective This research aimed to investigate the expression of osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of nuclear factor-κB ligand （RANKL） in mandibular distraction osteogenesis （DO） regulated by parathyroid hormone （PTH）and to explore the mechanism by which PTH promotes DO.MethodsA rabbit mandibular DO model was established.The rabbits were randomly divided into experimental group and control group.The former were subcutaneously injected with different doses of PTH on alternate days, the latter was injected with normal saline every other day.Serum OPG levels were detected through enzyme-linked immunosorbent assay.The OPG and RANKL expression levels in the DO-induced formation of a new bone tissue were examined through immunohistochemistry staining.ResultsThe serum OPG levels gradually increased during distraction.At the end of the stretch, the OPG expression in the experimental group was significantly stronger than that in the control group.As the fixed period was extended, the OPG expression in the new bone gradually decreased, but the RANKL expression increased.ConclusionIntermittent subcutaneous PTH injection can upregulate the OPG expression and accelerate bone metabolism.Thus, this procedure promotes the early generation of a new bone in the mandible through DO.

[中图分类号]R 782

[文献标志码]A [doi]10.7518/hxkq.2016.03.004

[收稿日期]2015-12-12； [修回日期]2016-03-06

[基金项目]国家自然科学基金（81160130）

[作者简介]李永頔，硕士，E-mail：lyd8906932@qq.com

[通信作者]唐正龙，教授，博士，E-mail：zhenglongtang@hotmail.com