食品动物源大肠杆菌耐药性分析及16S rRNA甲基化酶基因的检测

王　爽，邓向东，闫国栋，冯彩峰，代鹏飞，高彤彤,林居纯

(四川农业大学 动物医学院， 四川 成都 611130)



食品动物源大肠杆菌耐药性分析及16S rRNA甲基化酶基因的检测

王爽，邓向东，闫国栋，冯彩峰，代鹏飞，高彤彤,林居纯

(四川农业大学 动物医学院， 四川 成都 611130)

[摘要]【目的】 对四川地区临床分离的437株健康动物源及82株患病动物源大肠杆菌(E.coli)的耐药性及其机制进行研究，为临床合理用药提供理论依据。【方法】 用3种氨基糖苷类药物和11种非氨基糖苷类药物对分离的大肠杆菌进行药物敏感性试验(K-B纸片法)。选取至少耐1种氨基糖苷类药的大肠杆菌作为供试菌，通过PCR检测其16S rRNA甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE和npmA；对阳性菌株进行质粒接合试验；并用K-B纸片法分析临床菌和接合子对抗生素的敏感性。【结果】 437株健康动物源和82株患病动物源大肠杆菌对14种抗菌药物表现出不同程度的耐药性。健康动物源大肠杆菌对氨苄西林、氯霉素、磺胺甲恶唑的耐药率较高，分别为69.79%，50.8%和68.72%，对庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星比较敏感，敏感率分别为75.97%，67.73%和97.02%；其中有134株分离菌至少对1种氨基糖苷类药物表现出耐药性。患病动物源大肠杆菌除对美罗培兰耐药率较低(为3.66%)外，对其余药物的耐药率在32.93%～100%，且都对至少1种氨基糖苷类药物表现出耐药性。多重耐药分析表明，健康动物源大肠杆菌主要分布于0～4耐，而患病动物源大肠杆菌至少耐7种抗菌药物，主要分布于10～14耐。在134株耐氨基糖苷类抗生素大肠杆菌中，检测到5株含rmtB基因，检测率为3.73%，未检测到armA、rmtA、rmtC、rmtD、rmtE和npmA基因。在82株患病动物源大肠杆菌中，检测到1株含armA基因，10株含rmtB基因，检出率分别为1.22%和12.2%，未检测到rmtA、rmtC、rmtD、rmtE及npmA基因；接合试验的耐药质粒传递率为100%，受体菌接合频率在(9.2×10-9)～(4.8×10-6)。【结论】 四川地区健康动物源大肠杆菌对抗生素呈中低水平耐药，多重耐药以4耐及以下为主，占63.84%，主要由rmtB基因引起；而患病动物源大肠杆菌对抗生素则呈高水平耐药，89.02%为10～14耐，主要由rmtB和armA基因引起。

[关键词]大肠杆菌；16S rRNA甲基化酶；耐药性

氨基糖苷类抗生素由于其高效、广谱的特性以及具有浓度依赖性快速杀菌作用，临床上一直用于治疗革兰阴性菌所致的严重感染，但随着其在临床上的广泛应用，大肠杆菌等革兰氏阴性菌对其的耐药性也迅速增强[1]。自2003年以来，16S rRNA甲基化酶在临床菌中的发现，使革兰氏阴性杆菌的核糖体16S rRNA甲基化酶逐渐成为氨基糖苷类抗生素耐药新机制的研究热点[2]。该类酶主要通过甲基化16S核糖体亚单位A位点的某个或某几个碱基，使氨基糖苷类药物不能与其作用靶点相结合，从而保护细菌的16S rRNA，导致细菌对氨基糖苷类药物产生高度耐药性[3]。编码16S rRNA甲基化酶的基因有rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、npmA和armA等[4-8]，其与质粒、转座子、整合子、插入序列共同区等可移动遗传因子密切相关，可能通过接合、转化等质粒转移方式使该类酶的耐药决定因子在不同地域间及遗传上不相关的菌株之间进行扩散，从而在更广泛的地区导致更多的临床菌对氨基糖苷类抗生素产生高度耐药性[3,6,9-11]。本研究以四川地区分离的437株健康动物源和82株患病动物源大肠杆菌作为受试菌株，测定其对氨基糖苷类药物的耐药性及耐药菌株的耐药决定因子转移情况，以阐明健康动物源大肠杆菌和患病动物源大肠杆菌对氨基糖苷类药物的耐药性差异，以及其16S rRNA甲基化酶和基因型的分布、转移情况，为本地区大肠杆菌病的流行病学及临床用药提供参考依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株2012～2013年，从四川成都、雅安、蒲江、资阳、荥经、天全等不同养殖场临床分离的437株健康动物源和82株患病食品动物源大肠杆菌，经Vitek-60 微生物鉴定系统鉴定确认为大肠杆菌，所涉及食品动物源包括猪、牛、鸡和鸭；大肠杆菌ATCC25922(作为药敏质控菌)，由四川农业大学动物试验中心提供；大肠杆菌J53AzR(对叠氮钠耐药，作为接合试验的受体菌)，由四川农业大学药学实验室保存。

1.1.2抗菌药敏片氨基糖苷类药物：庆大霉素(10 μg/片)，卡那霉素(30 μg/片)，阿米卡星(30 μg/片)。非氨基糖苷类药物：阿莫西林/棒酸(阿莫西林20 μg/片，棒酸10 μg/片)，氯霉素(30 μg/片)，磺胺甲恶唑(30 μg/片)，美罗培兰(10 μg/片)，氨苄西林(10 μg/片)，头孢唑林(30 μg/片)，头孢噻肟(30 μg/片)，头孢曲松 (30 μg/片)，多西环素 (30 μg/片)，萘啶酸(30 μg/片)，环丙沙星(5 μg/片)，上述材料均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.3培养基和试剂麦康凯琼脂、伊红美兰琼脂和营养琼脂均购自杭州天和微生物试剂有限公司；MH肉汤、MH琼脂购自北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂糖购自基因公司(西班牙生产，上海Yito责任有限公司分装)；冰乙酸、EDTA、Tris碱，购自成都市科龙化工试剂厂；DNA Marker DL2000、 2×TaqPCR MasterMix、goldView,购自天根生化科技(北京)有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物，购自英国Oxiod公司。

1.1.4主要仪器微量可调加样器(德国Eppendorf公司)，自动立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂，型号SYQ-LDZX-40BZ)，电热恒温干燥箱(重庆华茂仪器有限公司，型号DGF25012C)。PCR仪和电泳成套设备(北京市六一仪器厂)，WaterPro Plus超纯水仪(LABCONCO公司)，GelDoc2000凝胶成像系统(Bio-rad公司)，高速冷冻离心机(Sigma公司，型号2K15)。

1.1.5引物16S rRNA甲基化酶基因引物序列见表1，均由上海生工生物工程技术有限公司(北京)合成。

表 1　16S rRNA甲基化酶基因的PCR引物序列

1.2临床菌的药物敏感性测定

以大肠杆菌ATCC25922作为药敏质控菌，采用美国临床试验标准化协会(CLSI)推荐的K-B纸片法测定临床分离菌对氨基糖苷类代表药物庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星及其他11种非氨基糖苷类药物的敏感性。

1.3氨基糖苷类耐药基因的PCR扩增

采用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)检测rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、npmA和armA7种16S rRNA甲基化酶基因，以煮沸法提取的大肠杆菌全基因组DNA作为PCR模板。PCR反应体系总体积为25 μL，其中模板1 μL，F引物0.5 μL，R引物0.5 μL，2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，加无菌双蒸水至25 μL。rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE和nPmA基因扩增的热循环参数为：94 ℃变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。armA基因扩增的热循环参数为95 ℃变性5 min；95 ℃变性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。

1.4PCR产物检测

取5 μL PCR产物在含有GoldView的1.0%的琼脂糖凝胶中进行电泳，通过GelDoc2000凝胶成相系统观察结果并拍照。将阳性产物送上海生工生物工程技术有限公司(北京)进行测序，测序结果用Blast进行比对分析。

1.5接合试验

以扩增出armA和rmtB基因的动物源大肠杆菌为供体菌，以对叠氮钠耐药的大肠杆菌J53AzR为受体菌进行试验。取对数生长期的供体菌、受体菌菌液各500 μL，接种于同一新鲜的4 mL LB肉汤中，37 ℃恒温静置培养7～8 h，让其接合。取上述混合菌液100 μL于胰蛋白胨大豆琼脂平板上(含64 μg/mL阿米卡星和200 μg/mL叠氮钠)，37 ℃恒温培养箱中倒置培养24 h，在上述含药平板上同时设置供体菌、受体菌对照；挑取在含药平板上生长的菌落，转接于相应的含药胰蛋白胨大豆琼脂平板上，可生长的菌落即为疑似接合子。

1.6接合子的PCR鉴定

随机挑取每个选择性平板上的3～5个单菌落进行PCR鉴定，试验方法同1.2节。

1.7接合频率的计算

计数接合子、供体菌和受体菌菌落数，分别计算其平均值和供、受体菌的接合频率，Fc=T/A×100%，其中，Fc为接合频率，T为接合子平均菌落数；A为受体菌或供体菌平均菌落数。

1.8接合子和J53AzR的药物敏感性测定

对接合子和J53AzR的药物敏感性进行测定，测定方法同1.2节。

2结果和分析

2.1大肠杆菌的药物敏感性结果

供试大肠杆菌的药物敏感性测定结果见表2。

表 2　437株健康动物源性和82株患病动物源大肠杆菌对14种药物的耐药情况

注：“S”.敏感率；“I”.中介率；“R”.耐药率。

Note：“S”.Susceptible ratio;“I”.Intermediate ratio;“R”.Resistant ratio.

从表2可看出，健康动物源大肠杆菌对氨苄西林、氯霉素、磺胺甲恶唑耐药性较高，耐药率分别是69.79%，50.8%和68.72%，对庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星3种氨基糖苷类药物比较敏感，敏感率分别为75.97%，67.73%和97.02%；有134株菌至少对1种氨基糖苷类药物有耐药性。患病动物源大肠杆对萘啶酸、磺胺甲恶唑、卡那霉素耐药率高达100%，对美罗培兰耐药率为3.66%，对其余药物的耐药率在32.93%～97.80%。结果表明，患病动物源大肠杆菌较健康动物源大肠杆菌耐药性稍严重，但总的来说，大肠杆菌无论是健康动物源还是患病动物源其耐药情况都不容乐观。多重耐药结果(表3)表明，健康动物源大肠杆菌0耐至14耐均有分布，但以0～4耐为主，占63.84%；而患病动物源大肠杆菌对14种抗菌药物的多重耐药性更为严重，至少耐7种抗菌药物，89.02%为10～14耐。

表 3　437株健康动物源和82株患病动物源大肠杆菌对14种抗菌药物的多重耐药率

2.216S rRNA甲基化酶基因的检测

采用PCR对7种16S rRNA甲基化酶基因进行检测，在437株健康动物源大肠杆菌中，检测到5株含rmtB基因，检出率为1.14%，未检测到armA、rmtA、rmtC、rmtD、rmtE和npmA基因。在82株患病动物源大肠杆菌中，检测到1株含armA基因和10株含rmtB基因，检出率分别为1.22%和12.2%，未检测到rmtA、rmtC、rmtD、rmtE及npmA基因。

2.3接合子的PCR鉴定结果

取疑似接合子DNA，用armA和rmtB特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，得到与目的片段长度相符的条带(图1)。

图 1　大肠杆菌rmtB和armA基因接合子PCR电泳检测

2.4接合子频率的测定

本试验中所有临床阳性菌都能通过接合方式将16S rRNA甲基化酶基因传递给J53AzR，传递率为100%。接合频率计算结果显示，armA阳性菌的供体菌接合频率为3.6×10-9，rmtB阳性菌的供体菌接合频率在(5.7×10-11)～(3.2×10-6)；armA阳性菌的受体菌接合频率为6.7×10-7，rmtB阳性菌的受体菌接合频率为(9.2×10-9)～(4.8×10-6)。

2.5接合子及原菌株对供测氨基糖苷类药物的敏感性比较

接合子对3种氨基糖苷类代表药物的敏感性略高于临床阳性菌，但远远低于J53AzR，说明16S rRNA甲基化酶基因在转移到受体菌后使阴性受体菌对氨基糖苷类药物及其他11种非氨基糖苷类药物产生了较高的耐药性。

3讨论

四川地区临床分离的大肠杆菌无论健康动物源还是患病动物源都有很高的耐药性。437株健康动物源大肠杆菌除对美罗培兰(0.46%)和阿米卡星(2.98%)耐药率较低外，对其他大多数抗菌药物的耐药率在10.76%～69.79%。82株患病动物源大肠杆菌对萘啶酸、磺胺甲恶唑、卡那霉素耐药率高达100%，对美罗培兰的耐药率为3.66%，对其余药物的耐药率在32.93%～97.8%，低于孙慧等[16]的相关报道，这可能与大肠杆菌的耐药性存在地域差异性及菌种差异性有关。健康食品动物源大肠杆菌对氨基糖苷类3种代表药物的敏感率整体高于其他的非氨基糖苷类药物，而对患病动物源大肠杆菌，氨基糖苷类药物的优势则不明显，存在很高的耐药性，这可能是在频繁使用此类药物过程中，大肠杆菌对其的耐药性有所增强。有关学者认为，细菌对氨基糖苷类药物的耐药机制主要是细菌可以产生水解氨基糖苷类抗生素的酶，但这些酶并不能水解所有的氨基糖苷类抗生素，比如阿米卡星[17]。所以在本次研究中，大肠杆菌对阿米卡星的耐药率较低，但仍有菌株对阿米卡星耐药，尤其是患病动物源大肠杆菌。由此可见，产生氨基糖苷类抗生素酶并不是细菌耐药的唯一机制。目前研究认为，由质粒介导的16S rRNA甲基化酶是氨基糖苷类抗生素耐药的新的机制，其能使药物作用靶位16S rRNA G1405上的N-7位鸟苷变成甲基鸟苷或使A1408上的腺嘌呤N-1位甲基化，使细菌的30S核糖体16S rRNA与氨基糖苷类抗生素的亲和力下降，导致细菌对氨基糖苷类抗生素产生耐药性[17]。本研究从437株健康动物源大肠杆菌中检测出5株携带有rmtB基因，占1.14%；从82株患病动物源大肠杆菌中检测到1株含armA基因(占1.22%)和10株含rmtB基因(占12.2%)，低于陈玉霞等[18]的研究结果；检测到armA基因的菌株也能检测到rmtB基因，但未检测到rmtA、rmtC、rmtD、rmtE及npmA基因，这与陈玉霞等[18]的研究结果相符。在四川地区，健康动物源大肠杆菌对阿米卡星的耐药率为2.98%，患病动物源大肠杆菌的耐药率为32.93%；患病动物源大肠杆菌16S rRNA甲基化酶基因的检测率远高于健康动物源大肠杆菌，且检测出16S rRNA甲基化酶基因的阳性菌株都对阿米卡星耐药，说明16S rRNA甲基化酶可能是导致细菌耐阿米卡星的主要机制之一。

存在16S rRNA甲基化酶基因的阳性菌株对测试药物都表现出耐药性。对阿米卡星耐药的菌株对其他2种氨基糖苷类药物也都表现出耐药性，同时对其他非氨基糖苷类药物也表现出较高的耐药性，说明16S rRNA甲基化酶基因不但对氨基糖苷类抗生素具有耐药性，而且对非氨基糖苷类药物也具有耐药性，其对社会的危害性很严重。本试验中，所有临床阳性菌都能通过接合方式将16S rRNA甲基化酶基因传递给J53AzR，传递率为100%。在丁晓丽等[3]的报道中，armA基因不能通过质粒接合传递给受体菌，这与本次研究结果不符，其原因可能与接合试验菌株数多少或接合介质及接合时间等不同有关，但本试验接合频率与丁晓丽的报道相符。接合子对氨基糖苷类抗生素的敏感性略高于临床阳性菌，但远低于阴性菌，且16S rRNA甲基化酶基因可以以水平的方式进行传播的特性应引起社会的关注。

4结论

四川地区健康动物源大肠杆菌对抗生素呈低水平耐药，多重耐药性以4耐以下为主，占63.84%，主要由rmtB基因引起；而患病动物源大肠杆菌则呈高水平耐药，89.02%为10～14耐，主要由rmtB基因和armA基因引起。

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Analysis on resistance ofEscherichiacolifrom food of animal origin and detection of its 16S rRNA methylation enzymes

WANG Shuang,DENG Xiang-dong,YAN Guo-dong,FENG Cai-feng,DAI Peng-fei,GAO Tong-tong,LIN Ju-chun

(CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu,Sichuan611130,China)

Abstract:【Objective】 The resistance of 437 E.coli strains isolated from healthy animals and 82 E.coli strains separated from sick animals in Sichuan and the mechanism were investigated to provide basis for its clinical rational use.【Method】 Sensitivity test was conducted to examine the separated E.coli strains with three Aminoglycosides and 11 non-Aminoglycosides.The strains with resistant to at least one Aminoglycoside drug were selected and their 16S rRNA methylase genes (armA,rmtA,rmtB,rmtC,rmtD,rmtE and npmA) were detected by PCR.Plasmid conjugation experiment was also carried out to the positive strains and the drug susceptibility of clinical isolated bacteria and zygote to antimicrobial agents was executed by the Kirby-Bauer method.【Result】 A total of 437 strains of healthy animal origin and 82 strains of sicken animal origin showed resistance to 14 antibacterial drugs.The resistant rates of E.coli strains of healthy animal origin against ampicillin,chloramphenicol and sulfamethoxazole were higher than other tested drugs with the rates of 69.79%,50.8% and 68.72%,respectively.They were more sensitive to gentamycin,kanamycin and amikacin with sensitive rates of 75.97%,67.73% and 97.02%,respectively.There were 134 strains with resistance to at least one aminoglycoside drug.The resistant rates of sick animal derived E.coli to 14 antibacterial drugs were 32.93% to 100% except for meropenem (3.66%).They were all resistant to at least one aminoglycoside drug.Strains separated from health animal were resistant to 0 to 4 drugs at the same time but those from sick animal were resistant to 10 to 14 drugs.A total of 5 E.coli strains containing rmtB gene were detected among the 134 strains with detection rate of 3.73%,while armA, rmtA,rmtC,rmtD,rmtE,and npmA gene were not detected.One strain was detected to contain armA gene and 10 strains were detected to contain rmtB gene among the 82 strains from diseased animal,with detection rates of 1.22% and 12.2%,respectively.But rmtA,rmtC,rmtD,rmtE,and npmA gene were not detected.Trans-conjugation test showed that resistant plasmids pass rate was 100%,and conjugation frequency of each receptor cell was (9.2×10-9)-(4.8×10-6).【Conclusion】 In Sichuan,E.coli strains from healthy animals had low-level resistance and 63.84% were resistant to 4 or less antibiotics,which was mainly caused by rmtB.The E.coli separated from sick animals showed high-level resistance to antibiotics with 89.02% were resistant to 10-14 drugs,which was caused by rmtB and armA genes.

Key words:Escherichia coli;16S rRNA methylase;resistance

DOI：网络出版时间:2016-02-0209:3710.13207/j.cnki.jnwafu.2016.03.002

[收稿日期]2014-08-06

[基金项目]国家科技支撑计划项目(2012BAK01B02)

[作者简介]王爽(1990-)，女，河南南阳人，在读硕士，主要从事食品动物源细菌耐药性及其耐药机制研究。E-mail：domina77@126.com[通信作者]林居纯(1968-)，女，四川隆昌人，教授，博士，主要从事兽医药理学及毒理学研究。E-mail：juchunlin@126.com

[中图分类号]S859.7

[文献标志码]A

[文章编号]1671-9387(2016)03-0011-06