ICU患者分离金黄色葡萄球菌的耐药性及分子流行病学特征

徐修礼，周　珊，白　露，刘家云，马越云，郝晓柯

(第四军医大学西京医院全军临床检验医学研究所,陕西 西安　710032)

·论著·

ICU患者分离金黄色葡萄球菌的耐药性及分子流行病学特征

徐修礼，周珊，白露，刘家云，马越云，郝晓柯

(第四军医大学西京医院全军临床检验医学研究所,陕西 西安710032)

[摘要]目的了解某院重症监护病房(ICU)金黄色葡萄球菌的耐药特点及分子流行病学特征。方法收集2014年1—12月该院ICU分离的金黄色葡萄球菌，进行细菌鉴定及药物敏感性试验，采用金黄色葡萄球菌A蛋白(spa)分型及多位点序列分型(MLST)方法进行分型。结果160株金黄色葡萄球菌中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)120株(占75.00%)。MRSA对红霉素、克林霉素、左氧氟沙星的耐药率均>80%；MSSA对头孢唑林敏感，对红霉素、克林霉素、左氧氟沙星的耐药率分别为62.50%、35.00%、10.00%。spa分型和MLST结果显示，120株MRSA主要为ST239-t030、ST239-t037、ST5-t2460 3种型别，其中ST239-t030(105株，87.50%)为主要流行菌株，8个ICU均有检出；MSSA存在较多型别，ST59-t437仅在神经内科(8株)和消化科(2株)检出，ST6-t701、ST398-t3625、ST398-t1793和ST121-t2092分别仅在神经内科(7株)、麻醉科(5株)、神经外科(4株)和心外科(4株)检出。结论该院ICU MRSA分离率较高，以ST239-t030克隆株为主，存在医院内流行；不同型别MSSA在各科室内存在流行趋势。

[关键词]重症监护病房； 金黄色葡萄球菌； spa分型； MLST； 流行病学； 抗药性，微生物； 耐药性

[Chin J Infect Control，2016，15(5)：294-298]

金黄色葡萄球菌是引起医院感染和社区感染的主要病原体，其感染的发病率和病死率均较高[1]。金黄色葡萄球菌可以引起多种形式感染，如局部化脓性感染、肺炎、假膜性肠炎、心包炎等局部感染，也可引起血流感染、脓毒症等全身感染；特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)，是世界范围内引起医院感染的重要病原菌[2]。为了解某院重症监护病房(intensive care unit，ICU)分离的金黄色葡萄球菌分子流行病学特征，笔者收集ICU 2014年分离的金黄色葡萄球菌进行耐药性分析，并对其进行金黄色葡萄球菌A蛋白(staphylococcal protein A，spa)分型，同时进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)，为医院控制金黄色葡萄球菌感染提供帮助。

1材料与方法

1.1材料

收集2014年全年ICU临床分离的非重复金黄色葡萄球菌160株；标准质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC 25923。培养基及药敏纸片购于英国OXOID公司，聚合酶链反应(PCR)试剂和溶葡萄球菌素购于上海生工生物工程有限公司，DNA提取试剂盒购自德国Qiagen Company，全自动细菌药敏鉴定分析仪Phoenix-100、基因扩增仪和电泳仪等购自美国Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1药敏试验和MRSA鉴定分别采用K-B纸片法和头孢西丁纸片法，运用Phoenix-100和VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定分析仪进行检测和鉴定，按美国临床实验室标准化协会(CLSI)2014年规定的标准判定耐药(R)、中介(I)和敏感(S)。

1.2.2DNA提取依据Qiagen Company DNA提取试剂盒标准方法进行全基因组DNA提取，取15～20个菌株加入200 μL TE和4 μL溶葡萄球菌素，使菌落充分溶解；37 ℃ 100 r/min温育1 h，56 ℃ 100 r/min温育30 min，将裂解完全的液体180 μL转移至EP管，加入25 μL蛋白酶K和200 μL的Buffer AL,振荡混匀5 s，再加入200 μL无水乙醇振荡混匀5 s，将溶液加入DNeasy Mini Spin Column中，8 000 r/min 旋转1 min,静置后弃废液，用Wash Buffer 1和Wash Buffer 2冲洗，最后用100 μL Elution Buffer以 8 000 r/min旋转1 min将DNA洗脱。

1.2.3spa分型从GenBank数据库中检索出spa基因DNA序列，对应两端保守序列用Primer 6.0软件设计上下游引物序列：正向引物：5’-TAA AGACGATCCTTCGGTGAGC-3’，反向引物：5’-CAGCAGTAGTGCCGTTTGCTT-3’。以全基因组DNA为模板，在退火温度为60℃的条件下进行PCR操作[3]。PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序，测序后的结果在网站(http://spa.ridom.de)进行比对分型。

1.2.4MLST依据金黄色葡萄球菌7个管家基因(gmk、glpF、aroE、tpi、yqil、arcC、pta)对细菌进行分型。PCR反应引物及反应体系参考文献[4]，PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序。测序结果在网站上(http://www.mlst.net)进行比对，确定ST型别。

1.3数据分析

应用WHONET 5.6软件进行数据分析，同源性分析应用MEGA 5.0软件进行聚类分析并构建树状图。

2结果

2.1菌株来源及药敏结果

160株金黄色葡萄球菌标本来源为痰95株，脓性分泌物29株，引流液15株，血13株，组织和尿各3株，脑脊液2株。其中MRSA 120株(75.00%)，甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA) 40株(25.00%)。MRSA对红霉素、克林霉素、左氧氟沙星的耐药率均>80%；MSSA对头孢唑林敏感，对红霉素、克林霉素、左氧氟沙星耐药率分别为62.50%、35.00%、10.00%。见表1。

表1　ICU金黄色葡萄球菌对常用抗菌药物的耐药情况

2.2spa分型及MLST结果

spa分型将金黄色葡萄球菌菌株分为10个型别，其中以t030为主(105株，65.63%)，其次为t037(12株，7.50%)，t437(10株，6.25%)，t701(7株，4.38%)，t002(6株，3.75%)，t3625(5株，3.12%)，t2092、t091和t1793(均为4株，7.50%)，t2460(3株，1.87%)。PCR产物分子量在300 bp左右，PCR产物见图1。对7个管家基因进行PCR扩增，PCR产物分子量在450～600 bp之间。见图2。MLST共7种型别，分别为ST239(117株，73.13%)，ST59(10株，6.25%)，ST5、ST398(均为9株，11.25%)，ST6(7株，4.38%)，ST121、ST7(均为4株，5.00%)。对金黄色葡萄球菌分型结果显示，120株MRSA主要为ST239-t030、ST239-t037、ST5-t2460 3种型别，以ST239为主，117株(117/120，97.50%)，ST239为该院MRSA主要流行型别，特别是ST239-t030(105/120，87.50%)；而MSSA呈现多种分子型别，未发现主要型别。具体分型见表2。

2.3菌株同源性聚类分析及科室分布

采用MEGA软件进行亲缘关系分析，由树状图可知，MRSA菌株ST239-t030和ST239-t037亲缘关系较近，而MRSA型别与MSSA型别之间亲缘关系较远，并且同一科室菌株之间亲缘关系未发现明显一致。ST239-t030分布广泛，消化科、心外科、神经外科、神经内科、烧伤科、麻醉科、呼吸科和儿科8个ICU均有检出。ST239-t030 MRSA菌株为该院主要流行菌株，且存在医院内流行。MSSA不同型别分布科室间存在较大差异，如ST59-t437仅在神经内科(8株)和消化科(2株)检出；而菌株ST6-t701、

ST398-t3625、ST398-t1793和ST121-t2092分别仅在神经内科(7株)、麻醉科(5株)、神经外科(4株)和心外科(4株)检出。见图3、表3。

M:DNA分子量 Marker；1—10泳道分别为spa-t030、spa-t2092、spa-t1793、spa-t037、spa-t3625、spa-t437、spa-t091、spa-t00、spa-t2460、spa-t701

M:DNA分子量 marker；1—7泳道分别为gmk、glpF、aroE、tpi、yqil、arcC、pta基因

图2 ICU金黄色葡萄球菌MLST PCR产物电泳图

Figure 2Electrophoresis of PCR products ofS.aureusMLST in ICUs

表2　ICU 160株金黄色葡萄球菌spa分型及MLST结果

xh:消化科,xw:心外科,sw:神经外科,sn:神经内科,ss:烧伤科,mz:麻醉科,hx:呼吸科,ek:儿科;

图3 　ICU 160株金黄色葡萄球菌亲缘关系树状图

3讨论

该院ICU 2014年1—12月共分离金黄色葡萄球菌160株，其中MRSA菌株120株(占75.00%)，MSSA菌株40株(占25.00%)，可见MRSA的分离率远高于MSSA，且高于全国统计数据[5]。MRSA对多种抗菌药物，如青霉素类、大环内酯类、林可霉素类和喹诺酮类等均有较高耐药率，给临床抗感染治疗带来较大困难。目前，该院分离菌株尚未发现对万古霉素、利奈唑胺和替加环素耐药或中介的金黄色葡萄球菌。但近年来，已有报道对利奈唑胺耐药及万古霉素中介的葡萄球菌属细菌，应引起临床科室的高度重视；替加环素是新上市的抗菌药物，目前仍未有耐药或中介的葡萄球菌属细菌报道，对其感染具有较为理想的抗菌活性。

ICU中若发现MRSA感染，需要及时给予有效的抗感染治疗[6]，从而可以较快地控制病情发展，降低病死率。因此，明确不同医院及病区金黄色葡萄球菌分子型别，可以为临床医生给予有效、及时治疗提供可靠的流行病学依据[7]。spa分型是基于spa基因x区多态性建立的分型方法，MLST是基于7对管家基因序列测定分析而建立的分型技术。本研究联合spa分型与MLST方法对160株金黄色葡萄球菌进行分子分型，以增加菌株型别鉴定的准确性，同时便于国际间比对[4]。试验结果显示，该院MRSA以ST239-t030为主，所有ICU均有检出，是主要克隆株；该型别菌株MLST的等位基因(arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqil)序列号为：2-3-1-1-4-4-3，spa重复序列编号为：15-12-16-02-24-24。ST239-t030菌株主要在亚洲等地检出，我国上海、浙江等地区也有报道，且该克隆株为多重耐药菌株[8-9]。因此，ST239-t030菌株的医院流行、播散，应当引起医院感染管理部门和临床科室高度重视。MSSA感染分布显示，不同病区间存在差异，如菌株ST6-t701、ST398-t3625、ST398-t1793和ST121-t2092分别仅在神经内科、麻醉科、神经外科和心外科检出，上述流行趋势表明，MSSA菌株存在科室内传播，应当加强科室内部感染控制工作[10]。

以上实验数据表明，该院金黄色葡萄球菌ST239-t030克隆株的感染存在医院内播散趋势，这可能与不同菌株的地域分布差异有关。MSSA菌株在各科室内部分布也存在差异，可能与科室性质不同有一定关系。我们应该加强医院感染控制工作，采取有效措施，降低金黄色葡萄球菌医院内和科室内的播散。综上所述，联合两种分型结果及药敏数据分析，可以为医院控制金黄色葡萄球菌感染流行提供帮助。

[参 考 文 献]

[1]潘云军,刘慧,郭卫红,等.医院感染金黄色葡萄球菌的临床特征及耐药性分析[J]. 国际检验医学杂志, 2014, 35(4): 482-484.

[2]赵春江,王辉,刘颖梅,等.北京四家医院社区获得性甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌感染的流行病学调查[J].中华检验医学杂志, 2012,35(3): 237-242.

[3]邹自英,韩黎,熊杰,等.金黄色葡萄球菌临床分离株spa分型和耐药特征研究[J].中国感染与化疗杂志, 2014, 14(2): 142-145.

[4]徐修礼,王师,高佳节,等.某院近 5 年痰标本分离病原菌及耐药性分析[J].中国感染控制杂志, 2015，14(2)：89-93.

[5]贺文强,陈宏斌,赵春江,等.2010—2011 年中国 10 个主要城市金黄色葡萄球菌分子流行病学研究[J].中华微生物学和免疫学杂志,2013,33(4):247-251.

[6]林琳,王晶,万献尧,等.重症监护病房金黄色葡萄球菌分离株基因分型研究[J].中国实验诊断学,2014,18(11): 1822-1825.

[7]郭青青, 陈惠清.老年患者医院获得性金黄色葡萄球菌下呼吸道感染耐药性分析[J]. 中国感染控制杂志, 2014, 13(2): 115-116.

[8]Li T, Song Y, Zhu Y, et al. Current status ofStaphylococcusaureusinfection in a central teaching hospital in Shanghai, China[J]. BMC Microbiol, 2013, 13: 153.

[9]Li Y, Cao B, Zhang Y, et al. Complete genome sequence ofStaphylococcusaureusT0131, an ST239-MRSA-SCCmec type III clone isolated in China[J]. J Bacteriol, 2011, 193(13): 3411-3412.

[10] 牛瑞兵,郭利平,王新刚,等.医院获得性与社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性差异[J].中国感染控制杂志, 2015，14(7): 476-478.

(本文编辑：左双燕)

Characteristics of antimicrobial resistance and molecular epidemiology ofStaphylococcusaureusisolated from patients in intensive care units

XUXiu-li,ZHOUShan,BAILu,LIUJia-yun,MAYue-yun,HAOXiao-ke(InstituteofClinicalLaboratoryMedicineofPeople’sLiberationArmy,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the characteristics of antimicrobial resistance and molecular epidemiology of Staphylococcus aureus (S. aureus) in the intensive care units(ICUs) of a hospital. MethodsClinical isolates of S. aureus collected from ICUs between January and December 2014 were identified and performed antimicrobial susceptibility testing, then typed by staphylococcal protein A (spa) typing and multilocus sequence typing (MLST) methods. ResultsOf 160 isolates of S. aureus, 120 (75.00%) were methicillin-resistant S. aureus (MRSA). Resistance rates of MRSA to erythromycin, clindamycin,and levofloxacin were all >80%; methicillin-sensitive S. aureus (MSSA) were sensitive to cefazolin, resistance rates to erythromycin, clindamycin, and levofloxacin were 62.50%,35.00%, and 10.00% respectively. spa typing and MLST results showed that the main types of 120 isolates of MRSA were ST239-t030,ST239-t037, and ST5-t2460, the major epidemic strains were ST239-t030 (n=105,87.50%), and were isolated from 8 ICUs; MSSA had more types, ST59-t437 were detected only from department of neurology(n=8) and department of digestive diseases(n=2), ST6-t701,ST398-t3625,ST398-t1793, and ST121-t2092 were isolated from departments of neurology(n=7), anesthesiology(n=5), neurosurgery(n=4),and cardiac surgery(n=4)respectively. ConclusionIsolation rate of MRSA in ICUs in this hospital is high, ST239-t030 is the main type, which prevailed in hospital; different types of MSSA have epidemic trends in various departments.

[Key words]intensive care unit; Staphylococcus aureus; staphylococcal protein A typing; spa typing; multilocus sequence typing;MLST; epidemiology; drug resistance,microbial; drug resistance

[收稿日期]2015-12-10

[基金项目]陕西省自然科学基金资助项目(2014JM4188)

[作者简介]徐修礼(1962-)，男(汉族)，吉林省桦甸市人，副主任技师，主要从事细菌耐药机制及医院感染分子流行病学研究。 [通信作者]郝晓柯E-mail:haoxkg@fmmu.edu.cn

DOI:10.3969/j.issn.1671-9638.2016.05.002

[中图分类号]R181.3+2

[文献标识码]A

[文章编号]1671-9638(2016)05-0294-05