维生素D对慢性乙型肝炎患者免疫功能及抗病毒疗效的影响

何丽杰　王　静　笪宇蓉

(天津医科大学，天津300070)



维生素D对慢性乙型肝炎患者免疫功能及抗病毒疗效的影响

何丽杰王静笪宇蓉

(天津医科大学，天津300070)

[摘要]目的：探讨25羟维生素D3对慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴细胞免疫功能及抗病毒疗效的影响。方法：收集慢性乙型肝炎患者70例。采用电化学发光法测定血清25羟维生素D、荧光定量聚合酶链反应技术检测乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)血清标志物，采用免疫荧光标记法测定外周血T淋巴细胞亚群数目。根据血清维生素D水平将患者分为维生素D低水平组、中水平组和高水平组，分别对3组患者给予长效干扰素治疗6个月，并于相应时间检测T淋巴细胞亚群数目、肝功能、病毒学指标。结果：3组患者在性别、年龄两两比较上无统计学差异。随着血清维生素D水平的升高，CD3+、 CD4+、CD4+/CD8+显著性升高,而CD8+逐渐降低，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。干扰素的治疗能明显改善T细胞各亚群，并且高水平组改善更明显。干扰素的治疗能明显改善患者的病毒学指标，高水平组患者能获得较好的病毒学应答。随着血清维生素D水平的升高，HBeAg、HBsAg阳性率以及HBV DNA的含量逐渐降低,低水平组与中等水平组、高水平两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。然而不同水平维生素D组，患者的肝功能无明显差异。结论：维生素D可能参与慢性乙型病毒性肝炎免疫功能的调节并与免疫耐受的形成有关，高水平的维生素D可以获得持续的病毒学应答，这可能为慢性乙型病毒性肝炎发病机制的研究和治疗提供新的思路。

[关键词]25羟维生素D3；T淋巴细胞亚群；病毒学应答

慢性乙型肝炎(慢乙肝)是全球肝病的主要原因,并且其与肝硬化和肝细胞癌的发生风险增加明显相关。据世界卫生组织统计，目前全球曾感染过HBV的有20亿人，其中3.5亿人为慢性感染，每年约有100万人死于HBV相关的肝衰竭或原发性肝癌[1]。乙肝病毒感染时病毒的消长和肝脏病变的发展取决于机体免疫应答的性质、强度和范围，机体有效的细胞免疫应答是控制病毒感染的关键，目前关于HBV感染后机体免疫功能的调节机制还不明确[2]。

维生素D为类固醇衍生物，可以通过食物补充，也可以通过皮肤光照7-脱氢胆固醇异构而成；维生素D进入血液循环后与维生素D结合蛋白(VDBP)结合，生成25-羟维生素D3，作为评估机体维生素D水平最可靠的指标[3]。根据美国内分泌学会的标准[4]，血清25(OH)D3 水平低于50 nmol/L (20 ng/ml)定义为维生素缺乏(Vitamin D deficiency)，介于50～75 nmol/L(20～30 ng/ml)之间定义为维生素D不足(Vitamin D insufficiency)。近年来随着分子生物学的发展，维生素D的很多功能逐渐被很多学者熟知以及进一步研究。研究发现，维生素D与细胞因子的作用机制类似,通过细胞信号传导通路广泛参与机体免疫系统的调节[5]。并且机体内某些免疫细胞，如单核巨噬细胞等，含有维生素D合成酶，可以将血清中低活性的维生素D转换成高活性1,25-(OH)2维生素D3，进而通过自分泌或旁分泌在局部参与免疫细胞功能的调节[6]。另外还有学者研究T淋巴细胞亚群的体外试验发现，维生素D是T淋巴细胞迁移和归巢的重要调节因素，并且进一步参与 T淋巴细胞的分化和诱导免疫耐受的产生[7,8]。

基于近期对维生素D功能的研究，本研究通过收集未治疗的慢性乙型肝炎患者血清和干扰素治疗6个月后同期患者的血清，分析患者基线水平的维生素D对慢性乙型肝炎患者免疫功能以及抗病毒治疗疗效的影响。

1材料与方法

1.1材料μ-Quant 酶标分光光度仪(美国 Bio-Tek公司)、ELISA试剂盒(美国Abcam公司)，T淋巴细胞分选磁珠(美国 BD公司)。

1.2血清标本收集70例慢性乙型肝炎患者来自2014年6月至2015年1月天津市第五中心医院收治的患者，男42例，女28例，患者基本信息见表1。所有患者均符合中华医学会肝病学分会和感染病学分会2010年制订的《乙型肝炎防治指南》 中慢性乙型病毒性肝炎标准[9]，排除合并其他病毒性肝炎、酒精性肝炎以及其他慢性肝病，无合并急慢性感染、冠心病、糖尿病、肾脏疾病等。纳入患者之前均未接受任何抗病毒药物和免疫调节剂治疗，给予长效干扰素肌内注射治疗，每次6 MIU，每2 d一次，分别于0个月、1个月、3个月、6个月检测患者的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+。同时检测患者肝功血清谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、总胆红素(Total bilirubin，TBIL)以及病毒学指标表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)、病毒颗粒(HBV-DNA)。

1.3实验分组根据血清25-羟维生素D，将所有患者分为3组，即低水平组：血清25-羟维生素D<20 ng/ml；中等水平组：20 ng/ml≤25-羟维生素D<30 ng/ml；高水平组：25-羟维生素D≥30 ng/ml。

1.4实验方法所有患者在对应时间于清晨空腹采取5 ml，EDTA抗凝血，1 000 r/min，离心15min，淋巴细胞分离液分选淋巴细胞，T淋巴细胞磁珠分选相应亚群T淋巴细胞。肝功能指标ALT、AST、TBIL采用日本Olympus全自动生化分析仪检测,试剂由罗氏诊断产品(上海)有限公司提供。病毒学指标HBsAg、HBeAg、HBV-DNA检测采用荧光定量聚合酶链反应技术，仪器购自美国伯乐公司生产Icycler IQ，试剂由深圳匹基生物工程股份有限公司提供。

2结果

2.1各组基本信息统计3组患者年龄、性别、基线水平的肝功能以及病毒学指标，结果表明3组之间的年龄、性别比之间无明显差异，治疗前不同25羟维生素D3水平组患者肝功能无明显差异，而病毒学指标HBsAg和HBeAg阳性例数以及HBV DNA 含量25羟维生素D3低水平组和中水平组较高水平组要高，有明显差异，差异有统计学意义，见表1。

2.2各组T淋巴细胞亚群的比较流式细胞技术检测3组T淋巴细胞比例，结果发现CD3+、CD4+随着25羟维生素D3水平的升高，免疫细胞数量逐渐升高，高水平组较低水平组和中水平组均有明显差异，差异有统计学意义；而CD8+亚群细胞数结果则相反，高水平组较低水平组和中水平组均有差异，差异有统计学意义；CD4+/CD8+比值随着25羟维生素D3水平的升高逐渐增大，差异有统计学意义。患者给予长效干扰素治疗后于1个月、3个月和6个月检测患者T淋巴细胞亚群的变化，发现各细胞亚群均有不同程度的改善，CD3+、CD4+随着治疗时间的延长逐渐升高至恢复正常，而CD8+逐渐降低，分析结果发现25羟维生素D3高水平组T细胞亚群改善较其他两组明显。具体结果见图1、2。

表1各组患者临床基本资料

Tab.1Baseline characteristics of each group

LowvitaminDgroupMidvitaminDgroupHighvitaminDgroupPvaluen203416M/F11/822/129/8Years35.500±4.75033.180±5.62030.630±7.5600.440ALT88.230±7.01085.740±6.83089.340±8.7800.360AST40.310±6.24038.370±8.21039.440±6.8900.470TBIL17.230±4.72016.980±3.84017.010±4.0500.180HBsAg(positive,n)203190.001HBeAg(positive,n)173080.001HBVDNA(log10copies/ml)7.030±2.3006.450±1.8904.890±1.5600.003

Note：Pvalue：High vitamin D group vs low vitamin D group.

图1　各组CD4+、CD8+T细胞亚群治疗前和治疗6个月的含量检测流式图Fig.1　Results of peripheral blood CD4+ and CD8+T lymphocyte subsets before and after 6 months treatment in each group

图2　各组外周血淋巴细胞亚群检测结果±s)Fig.2　Results of peripheral blood T lymphocyte subsets in each ±s)Note: *.P<0.01.

2.2各组治疗后肝功能的变化3组患者给予长效干扰素抗病毒治疗6个月后，分别与1个月、3个月和6个月复查肝功能指标ALT、AST、TBIL，3组患者肝功能较治疗前均有明显改善，各组之间ALT、AST、TBIL的变化无明显差异，差异没有统计学意义，见图3。

2.3各组治疗后病毒学指标的变化3组患者给予长效干扰素抗病毒治疗6个月后，分别于1个月、3个月和6个月复查病毒学指标HBsAg、HBeAg和HBV DNA含量，发现随着干扰素的治疗，3组患者HBsAg和HBeAg阳性例数均有减少，并且治疗6个月后高水平组e抗原阳性患者均有e抗原血清学转换，而s抗原阳性患者有一半患者转阴，HBV DNA含量明显降低，有一部分患者检测不到HBV DNA。结果见图4、表2。

图3　各组治疗后肝功能变化Fig.3　Improvement of liver function during each group

图4　各组的HBV DNA的变化Fig.4　Improvement of HBV DNANote: *.P<0.01.

表2各组治疗后病毒学指标的变化

Tab.2Improvement of virus serological markers during each group

LowvitaminDgroupMidvitaminDgroupHighvitaminDgroupP1P2BeforetreatmentHBsAg(positive,n)203190.0010.0001HBeAg(positive,n)173080.0010.0007OnemonthHBsAg(positive,n)192870.0010.0001HBeAg(positive,n)152870.0010.0007ThreemonthsHBsAg(positive,n)172550.010.001HBeAg(positive,n)102030.010.001SixmonthsHBsAg(positive,n)162330.0010.0001HBeAg(positive,n)91500.0010.0001

Note：P1 value:High vitamin D group vs low vitamin D group;P2 value:High vitamin D group vs mid vitamin D group.

3讨论

慢性乙型病毒性肝炎是一种异质性疾病，不同患者病毒复制水平高低不等，肝组织炎症轻重各异，反映机体对病毒不同的免疫状态[1]。乙型肝炎患者普遍存在细胞免疫功能紊乱。外周血T淋巴细胞亚群是反映机体免疫状态和功能的指标，对某些疾病的辅助诊断、分析发病机制、观察疗效及监测预后有重要意义。乙型肝炎患者中T细胞免疫主要对HBV清除和控制、肝组织病理损伤方面发挥作用，对疾病的转归有重要影响[10]。

T淋巴细胞亚群是机体关键性免疫活性细胞，是目前临床上最常用的反映免疫功能状态的指标，根据T细胞表面CD分子表达可将成熟的T淋巴细胞分为CD4+和CD8+细胞两大类，每一类均为非均一的细胞群体，进一步可分为效应性T细胞或调节性T细胞，T细胞总数或不同T细胞亚群的绝对数或比值发生改变，可视为免疫异常，可能与某些疾病的发生与发展有关，而CD4+/CD8+比值则反映了机体免疫功能有无紊乱。

目前研究发现，维生素D的水平与人体免疫功能存在一定联系，且被认为属于神经内分泌-免疫调节激素，能够介导单核细胞进行分化，调控活化T细胞或使调节性T细胞迁移和归巢，并且促进T淋巴细胞的分化和诱导免疫耐受[11,12]。研究发现机体的维生素D的水平与慢性肝病之间有一定联系。Petta等[13]研究表明较高水平的维生素D可以预示患者抗丙肝治疗能获得较好的或是持续的病毒学应答。另外还有学者研究慢性乙型肝炎患者机体维生素D水平，发现高病毒载量患者一般机体维生素D明显不足，甚至缺乏，同时还发现那些高水平维生素D水平患者进行抗病毒治疗后能获得更好的e抗原、s抗原的血清学转换；然而研究发现机体维生素D的含量与慢性肝病患者肝功能的改善无明显影响[14-16]。

本研究对25羟维生素D3对慢性乙型肝炎患者免疫功能及抗病毒疗效的影响进行临床研究。研究发现25羟维生素D3低水平组、中水平组比高水平组，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+逐渐升高，而CD8+逐渐降低，这一结果表明慢性乙型肝炎患者机体维生素D的水平与机体的免疫状态或是免疫异常存在一定联系。并且给予患者长效干扰素抗病毒治疗后，不同维生素D水平组患者的免疫状态均有改善，并且高水平组改善较另外两组明显一些。这一结果表明机体内高水平的25羟维生素D3可能促进机体T淋巴细胞的分化、迁移，从而导致机体的免疫耐受，减少炎症因子对机体的损伤。本研究还发现高水平组患者的病毒载量以及e抗原阳性和s抗原阳性患者数较低水平组和中水平组要低，并且随着抗病毒的治疗，我们发现高维生素D水平组患者能更好地获得病毒学应答，HBV病毒载量明显降低甚至有些患者检测不到病毒载量，e抗原的血清学转换率以及s抗原的清除率也较低水平组和中水平组高。而3组患者之间的肝功能无明显差异，这表明维生素D的水平与慢性肝病肝功能的状态具有相关性。这些实验结果与以上学者研究是一致的，表明维生素D的水平可能与慢性乙型肝炎的发病机制以及抗病毒治疗的病毒学应答有一定联系。机体较高水平的25羟维生素D3患者能够获得较好的抗病毒治疗效果，可能是因为较高的25羟维生素D3水平能够促进T淋巴细胞向受损的以及炎症反应较重的肝组织迁移，从而改善机体的损伤，同时较高的25羟维生素D3水平能够诱导机体的免疫耐受，减少机体炎症因子的释放，减轻炎症反应。

综上所述，维生素D作为微量元素，具有很多功能，能够调节机体的免疫功能，对各种疾病状态下的免疫状态有一定的调控作用。本研究发现25羟维生素D3对慢性乙型肝炎患者T淋巴细胞亚群和病毒学应答有一定影响，这可能为慢性乙型病毒性肝炎发病机制的研究提供新的思路。

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[收稿2015-10-15修回2015-10-29]

(编辑倪鹏)

Effect of serum Vitamin D levels on cellular immunity and antiviral effects in chronic hepatitis B patients

HELi-Jie,WANGJing,DAYu-Rong.

TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China

[Abstract]Objective:To study the effect of vitamin D on peripheral blood T lymphocyte subsets and antiviral effects in chronic hepatitis B patients.Methods: The clinical data for 70 patients with chronic hepatitis B were analyzed.These patients were divided into three groups based on serum 25-hydroxy vitamin D level.Serum 25-hydroxy vitamin D was determined by electrochemical luminescence,and hepatitis B virus serological markers was determined by fluorescence quantitative polymerase chain reaction.Subsets of T lymphocytes were determined by flow cytometry.Results: The age and ratio of gender had no difference during these three groups. The proportion of CD3+,CD4+T lymphocyte and the ratio of CD4+/CD8+ increased (P< 0.05) significantly as the increase of 25-hydroxy vitamin D levels,but the proportion of CD8+ decreased.Interferon treatment could improve the T cells subgroup,and high level of serum 25-hydroxy vitamin D group improved more obviously.The treatment of interferon could obviously improve the hepatitis B virus serological markers,high level group of serum 25-hydroxy vitamin D could obtain better virological response.The positive of HBeAg,HBsAg and the titer of HBV DNA decreased with the increase of serum vitamin D,and the difference between the high and low level of 25-hydroxy vitamin D groups were significant.However,there were no significant difference between 3 groups of serological markers of liver function.Conclusion: Vitamin D may play a part in the immune tolerance in the nature course of chronic HBV infection,and high levels of vitamin D may be able to achieve sustained virological response.This findings may shed light on the immunotherapy of chronic hepatitis B.

[Key words]25-hydroxy vitamin D3；T lymphocyte subsets；Virological response

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.029

作者简介：何丽杰(1986年-)，女，在读硕士，主要从事免疫学方面的研究,E-mail：helijie39@163.com。通讯作者及指导教师：笪宇蓉(1971年-)，女，博士，副研究员，主要从事细胞因子信号传导通路与自身免疫性疾病，E-mail：dayr@tijmu.edu.cn。

中图分类号R512.6+2

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)05-0729-05